Здесь мы предоставляем подробный протокол для проведения в естественных условиях сердечной гена редактирования мышей с использованием рекомбинантного вируса Adeno-Associated (rAAV)-опосредованной доставки ТРИФОСФАТЫ. Этот протокол предлагает многообещающие терапевтические стратегии для лечения дистрофических кардиомиопатия в мышечной дистрофии Дюшенна и может использоваться для создания сердца конкретных нокаут в послеродовой мышей.
Кластеризованный, регулярно interspaced, короткие, рецидивирующий повторить (ТРИФОСФАТЫ) системы в значительной степени способствовало генома в культивируемых клеток и организмов из различных видов техники. ТРИФОСФАТЫ технология была также изучена как Роман терапии для целого ряда заболеваний человека. Доказательства в концепция данные являются весьма обнадеживающими, как свидетельствуют последние исследования, демонстрирующие осуществимость и эффективность генов на основе редактирования терапевтический подход для мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) с помощью мышиных модели. В частности внутривенные и внутрибрюшинного введения rh.74 серотип рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) (rAAVrh.74) позволила сердца эффективности стафилококк ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (SaCas9) и два Руководство РНК (gRNA) для удаления геномной региона с мутант кодон в экзона 23 гена Dmd мыши. Этот же подход может также использоваться для Нокаут гена интереса и изучить их функции сердца в послеродовой мышей, когда gRNA предназначен для кодирования региона гена. В этом протоколе мы подробно показать, как инженер-rAAVrh.74 ТРИФОСФАТЫ вектор и как добиться высокоэффективных сердца доставки в новорожденных мышей.
Кластеризованный, регулярно interspaced, короткие палиндром повторить (ТРИФОСФАТЫ) технология представляет самые последние улучшения в геном инженерии и изменил существующую практику генетики в клетки и организмы. Основанный ТРИФОСФАТЫ генома редактирования использует один руководство РНК (gRNA) направить связанные ТРИФОСФАТЫ эндонуклеазы например ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) и Cpf1 геномной ДНК цель, которая дополняет в последовательности protospacer кодируемых gRNA с конкретных protospacer прилегающие мотив (PAM)1,2. Диспетчер PAM варьируется в зависимости от бактериальных вида Cas9 или Cpf1 гена. Наиболее часто используемым Cas9 Нуклеаза, производный от Streptococcus pyogenes (SpCas9) признает PAM последовательность NGG, найденной в геномной ДНК, на стренги непромысловых прямо вниз по течению от последовательности целевого объекта. На конечном сайте Cas9 и Cpf1 белки генерировать двухручьевой перерыв (DSB), который затем отремонтировать через встроенные клеточных ДНК ремонт механизмов, включая не гомологичных конец присоединения (NHEJ) и ориентированные на гомологии ремонт (HDR) пути3, 4. В отсутствие шаблона для гомологичная рекомбинация ДНК DSB главным образом отремонтированы по ошибкам NHEJ пути, что может привести к вставки или удаления (indels) нуклеотидов, вызывая мутации фреймшифт если ОУС были созданы в кодирование региона гена5,6. Таким образом система ТРИФОСФАТЫ широко использовался для инженер функция потерь мутации в различных клеточных моделях и весь организмов, для того, чтобы исследовать функции гена. Кроме того каталитически неактивных Cas9 и Cpf1 были разработаны для транскрипционно и эпигеномно модулировать выражение целевых генов7,8.
Совсем недавно, SpCas9 и SaCas9 (производное от золотистого стафилококка) были упакованы в векторы рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) для коррекции послеродовой гена в животной модели заболеваний человека, в частности, Дюшенна мышечная дистрофия (ДМД)9,10,11,12,13,14,15. ДМД это роковой Х-хромосомой рецессивных заболеваний вызванных мутациями в гене DMD , который кодирует белок делеций16,17, затрагивающих примерно один в 3500 мужчин рождений по данным обследования новорожденных18 , 19. Он характеризуется прогрессивная мышечная слабость и тратить. ДМД пациентов обычно теряют способность ходить между 10 и 12 лет и умирают дыхательной или сердечной недостаточности в возрасте 20-30 лет20. В частности, развивается кардиомиопатия > 90% пациентов DMD и является ведущей причиной смерти в ДМД пациентов21,22. Хотя Deflazacort (противовоспалительным наркотиков) и Eteplirsen (экзона, пропуская медицины для пропуска экзона 51) недавно были одобрены для ДМД продовольствия и медикаментов (FDA)23,24, ни один из этих методов лечения Исправьте генетический дефект на уровне геномной ДНК. Mdx мышь, которая носит Точечная мутация в экзона 23 делеций гена, широко используется как модель DMD25. Кроме того ранее мы показали, что функциональные делеций выражение был восстановлен в кадр удаления геномной ДНК, охватывающих экзонов, 21, 22 и 23 в скелетных мышцах мышей многомерных выражений с помощью внутримышечной Ad-SpCas9/gRNA доставки9 и в сердечной мышцы mdx/utrophin+ / мышей с помощью внутривенного и внутрибрюшной rAAVrh.74-SaCas9/gRNA доставки26.
В этом протоколе мы подробно каждый шаг в послеродовой сердечной гена редактирования для восстановления делеций в многомерных выражений/utrophin+ / мышей с использованием rAAVrh.74-SaCas9/gRNA векторов, от проектирования gRNA делеций анализа в разделах мышцы сердца.
В этом протоколе мы подробно все шаги, необходимые для достижения в естественных условиях сердечной гена редактирования в послеродовой мышей с помощью rAAVrh.74 опосредованной доставки SaCas9 и два оформления. Как отмечалось ранее, этот подход может использоваться для восстановления де…
The authors have nothing to disclose.
О.в. поддерживается США национальные институты здравоохранения грантов (R01HL116546 и R01 AR064241).
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
Horse serum | Abcam | ab139501 | |
Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |