İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil
Summary
Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Pankreas karmaşık bir organ kan glikoz homeostazı ve sindirimi düzenler için birlikte çalışan birçok farklı hücre türleri modülüdür. Bu hücre türleri acinar hücreleri, bir arborized duktal sistem gut ve hormon üreten endokrin hücrelere sorumlu enzimleri ulaşım için enzim salgılayan içerir.
Endokrin beta hücreleri tek hücre tipi vücuttaki insülin kan şekeri düzeylerini düşürmek için üretmek vardır. Diyabet, bir kayıp veya beta hücre fonksiyon bozukluğu ile karakterize bir hastalık salgın boyutlarına ulaşıyor. Böylece, araştırmak amacıyla filtreleme için ilaç ve tedavi hücre tabanlı türetmek için kullanılan beta-hücre gelişimi için iletişim kuralları kurmak için önemlidir. Fare geliştirme deneysel incelenmesi gerekli olmakla birlikte, in vivo çalışmalar zahmetli ve zaman alıcı vardır. Kültürlü hücreleri filtreleme için daha uygun bir platform sağlamak; Ancak, hücresel çeşitlilik, mimari organizasyon ve hücresel etkileşimlerin bulundu korumak edemiyoruz içinde vivo. Böylece, pankreas organogenesis ve Fizyoloji araştırmak için yeni araçlar geliştirmek esastır.
Hücreleri düzenleyebilir ve karmaşık, fizyolojik olarak yetkili yetişkin organ ayırt pankreas epitel hücreleri Mezenşim organogenesis başlangıcından ile yakın ilişki içinde geliştirmek. Pankreas Mezenşim birçoğu de henüz, böylece sırasında vitro kültür özetlemek zor anlaşılır değil önemli sinyalleri endokrin gelişmesi için sağlar. Burada, biz pancreatoids olarak adlandırdığı Mezenşim korumak kültür üç boyutlu, hücresel karmaşık fare organoids için bir iletişim kuralı tanımlamak. E10.5 fare pankreas bud disseke, ayrışmış ve iskele-Alerjik bir ortamda kültürlenir. Bunlar yüzen hücreleri gelişmekte olan pancreatoid ve endokrin beta hücreleri gelişmekte olan acinar ve kanal hücreleri ile birlikte sağlam bir dizi Zarflama Mezenşim ile kendini topla. Bu sistem organogenesis sırasında ya da uyuşturucu, küçük molekül veya genetik tarama için hücre kader tayini, yapısal organizasyonu ve morfogenez, hücre-hücre etkileşimleri eğitim için kullanılabilir.
Introduction
Normal gelişim ve fizyolojisi mekanizmaları operasyona hastalığı nedenleri anlamak ve sonuçta tedavi yöntemleri yetiştirmek için her şeyden önemlidir. Kültür ve kök hücre ayırt gelişimin hızlı ve yüksek üretilen iş analizi olanak sağlarken, bilgi ile ilgili hücre kader düzenleyen mekanizmalar mevcut vücut ile sınırlıdır ve yapay olarak gelişiminde beyannamedir bir nispeten homojen, iki boyutlu durum1,2. Sadece dışsal etkiler, farklı hücre tipleri niş ve çevre ile etkilenen vivo içinde geliştirme sağlayan parakrin sinyalleri ve örgütsel destek organogenesis rehberlik etmek, ama Ayrıca bu hücrelerin işlevini kullanır onların çevresi için rehberlik3,4,5. Bu dış yardımlar önemi, farklılaşma protokolleri sınırlamalar ve in vivo fare modelleri zahmetli doğası göz önüne alındığında, yeni sistemleri temel gelişimsel süreçleri ve Fizyoloji deneysel olarak araştırmaya ihtiyaç vardır.
Üç boyutlu, karmaşık organoids oluşturmak için iletişim kuralları ortaya çıkması organogenesis, fizyoloji, uyuşturucu etkinlik ve hatta patogenezinde. eğitim için uygun ve uyumlu bir sistem sağlar Mide ve bağırsak6 7 gibi farklı sistemleri organogenesis anlayışımızı genişlettik için fare organoids kurulması, gelişimsel karmaşıklığı vivo içinde daha az kısıtlamalarla çalışma için bir araç sağlayan ve vitro modelleri. Fare organoid bu gelişmeler nedeniyle oluşumu ve insan pluripotent gelişiyle kök hücreleri, insan bağırsak8, Retina9, böbrek10,11ve serebral12 organoids üretilen ve bu repertuar sadece gelişiminin mekanizmaları ile ilgili mevcut bilgi ile sınırlıdır.
Pankreas farklı hücre tipleri, ekzokrin pankreas yetmezliği13, pankreatit14, acinar hücrelerde acinar hücreleri ve kanalları dahil olmak üzere sayısız hastalıklar veba gibi özel ilgi pankreas organoids olduğunu ve Beta hücreleri diyabet15dakika sonra. Bu farklı hücre tipleri geliştirilmesi ile ilgili bilgi kazanıyor onların patoloji anlamada yardımcı olabilir ve ayrıca, kişiselleştirilmiş uyuşturucu tarama veya nakli için bir platform olarak hareket edebilir. Daha önce Greggio ve ark. vivo içinde morfogenez özetlemek ve tüm büyük pankreas epitel hücre oluşur organize, üç boyutlu, karmaşık yapıları geliştirmek fare pankreas organoids oluşturmak için bir yöntem geliştirdi 16,17türleri. Bu pankreas alanında önemli bir adım, özellikle yapım hücreleri vitro beta-hücre gelişimi biyolojik incelenmesi etkinleştirebilirsiniz. Ancak, organoids nerede etkileşim burnu ile Öğretim İpuçları17sağlamak dokusu içine nakledilen sürece bir kıtlık endokrin hücre bu protokol için kurdu. Mezenşim ağır endokrin delaminasyon ve farklılaşma3,4de dahil olmak üzere daha sonraki aşamaları için organogenesis erken aşamalarında gelen epitel gelişmekte olan Zarflama niş, en büyük kısmını teşkil eder, 18. Mezenşim etkileşim gelişmekte olan pankreas henüz dışsal sinyal ve in vivo hücresel karmaşıklık sürdürmenin önemini organogenesis çalışmak için başka bir örnektir.
Burada, pancreatoids, Disosiye e10.5 fare pankreas ataları olarak adlandırdığı üç boyutlu pankreas organoids oluşturmak nasıl açıklar. Bu pancreatoids yerel Mezenşim korumak, serbest dalgalı koşullarda kendini birleştirin ve endokrin beta hücreleri19sağlam bir dizi de dahil olmak üzere tüm büyük pankreas hücre tipleri oluşturmak. Önceki iletişim kuralları sağlam endokrin farklılaşma bulunmadığından bu yaklaşım endokrin geliştirme, analiz için uygundur. Ancak, pankreas organoids için iletişim kuralını kullanarak vd. daha iyi pankreas epitel dallanma ve morfogenez, analiz için uygun Greggio tarafından açıklandığı gibi dallanma olarak daha pancreatoids içinde sınırlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre kültür modelleri ilerlemesini düzgün geliştirme modeli, klinik hücre tipleri, test ilaç etkinliğini veya hastalara bile nakli üretmek için çok önemlidir. Biz hala organogenesis ve Fizyoloji mekanizmaları anlama çok uzak olduğu gibi ancak, yapay bir tabak içinde kalkınma recapitulating meydan okuyor içinde vivo. Böylece vitro hücre verimsiz oluşturulan, tam olarak fonksiyonel değil, uzun bir süre için muhafaza edilmesi veya diğer anormallikler vücuttaki karşılaştırıl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jolanta Chmielowiec Protokolü ve el yazması ile ilgili yararlı tartışma için teşekkür ediyoruz. Biz de Benjamin Arenkiel erişim confocal mikroskop için teşekkür ederim. Bu eser NIH (M.B. için P30-DK079638) ve T32HL092332-13 M.A.S ve M.B., McNair tıbbi Vakfı (M.B.) ve confocal özünde BCM fikri ve gelişme bozuklukları Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir (NIH U54 HD083092 Eunice üzerinden Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan gelişimi).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
