ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה
Summary
זיהוי של וריאציות גנטיות לתרום מחלות אנושיות מורכבות מאפשר לנו לזהות מנגנונים חדשניים. . הנה, נדגים הגישה מולטיפלקס genotyping של המועמד גנים או מסלול מפענוח ממקסם את הכיסוי במחיר נמוך, הוא נוטה מחקרי עוקבה מבוסס.
Abstract
מחלות מורכבות הן לעיתים קרובות ביסודה על ידי מספר גרסאות גנטי נפוץ שתורמים הרגישות למחלה. כאן, אנו מתארים גישה פולימורפיזם (הסנ פ) נוקלאוטיד יחיד של תג חסכונית באמצעות assay מרובבת genotyping של ספקטרומטר מסה, לחקור את הגן שיוכי מסלול קליני גדודים. אנחנו חוקרים את לוקוס המועמד אלרגיה למזון Interleukin13 (IL13) כדוגמה. שיטה זו הגדלת ביעילות את הכיסוי על-ידי ניצול משותף תאחיזה לא שוויונית (LD) בתוך אזור. SNPs LD הנבחר ואז נועדו לתוך מרובבת assay, המאפשרים עד 40 SNPs שונים להיות מנותח בו זמנית, לחיזוק משתלמת. תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) משמש כדי להגביר את לוקוסים היעד, ואחריהם סיומת נוקלאוטיד יחיד, ואת amplicons ואז נמדדים באמצעות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון-שעה של ספקטרומטר מסה flight(MALDI-TOF). הפלט גולמי ניתוח עם גנוטיפ מתקשר התוכנה, באמצעות חתך-offs, והגדרות בקרת איכות מחמירים, סבירות גבוהה אחרים ובאים פלט עבור ניתוח נתונים.
Introduction
מחלות אנושיות מורכבות, וריאציות גנטיות לתרום רגישות למחלות, לכימות גרסאות אלה עשויה להיות שימושית עבור פתוגנזה הבנה, זיהוי קבוצות מטופלים בסיכון גבוה, המגיבים לטיפול. אכן, ההבטחה של דיוק רפואה הוא תלוי ניצול מידע גנטי כדי לזהות קבוצות המטופל1. לרוע המזל, בתוך החלל ביולוגיה מחלה מורכבת, שבו המחלה פנוטיפים הם ביסודה על ידי ניכר הטרוגניות גנטית, penetrance נמוך, אקספרסיביות משתנה, עוקבה גודל דרישות עבור גישות הגנום כולו לזהות את הרומן המועמדים הם לעתים קרובות מדי גדול2. לחלופין, בגישה ג’ין המועמד יישוב מתחיל השערה אפריורי על גנים ספציפיים/מסלולים המחלה אטיולוגיה3. כלי ניתוח מסלול משמשות כדי לחקור הפתופיזיולוגיה של לוקוסים היעד מזוהה, יצירת מסלולים רבים המועמד כדי להבטיח את הזמנתכם. נדגים כאן בגישה genotyping מרובבת ומאפשר החקירה של עשרות למאות SNPs עם אחד assay, מתאים מחקרי עוקבה האנושי4. גישה זו היא גבוהה יחסית דרך-put, המתיר מאות אלפי דגימות די אן איי להיות genotyped ללימודי הרומן גילוי, חקירה של מסלולים ספציפיים. השיטות המתוארות כאן שימושיים עבור מזהה סיכון אללים ואגודות שלהם עם תכונות קליני באופן מהיר וזול יחסית. פלטפורמה זו היה מועיל מאוד סינון ואבחון למטרות5,6, ועוד לאחרונה, זיהום מיקרוביאלי7 ו וירוס הפפילומה האנושי8.
פרוטוקול זה מתחיל עם מבחר של קבוצת גנים לחקירה, כלומר., אזורי היעד, נקבע בדרך כלל דרך חיפוש ספרות, או אפריורי השערות על מעורבות תהליך המחלה; . או אולי מסומנת לצורך שכפול כמו אגודות מחקר הגנום כולו האגודה (GWA) גילוי המוביל. מקבוצת ג’ין, החוקר יבחר רשימה מעודן של תג SNPs. כלומר, תאחיזה לא שוויונית (LD), או קורלציה, בין גרסאות באזור משמש לזיהוי נציג ‘תג הסנ פ’ עבור חבורה של SNPs ב LD גבוהה, המכונה haplotype. תעודת הזהות גבוהה של האזור אומר כי SNPs לעיתים קרובות יורשים ביחד כך genotyping הסנ פ אחת מספיקה לייצג את הווריאציה-SNPs כל ב- haplotype. לחלופין, אם עוקב אחרי רשימה סופית של SNPs מאזורים רבים, למשל., שכפול למחקר GWA, תהליך זה עשוי להיות מיותרים. עבור מרובבת genotyping, וזמינותו ואז להיות מתוכננים סביב היעדים הללו כך תחל ההגברה של שונות המוני לאלה של תחל סיומת, מוצרים כדי לייצר interpretable המוני ספקטרה. פרמטרים אלה מיושמות בקלות על ידי כלי עיצוב genotyping מרובבת וזמינותו. תחל ואחורה של עיצוב זה ישמש כדי למקד את סמני עניין ומגבירים את רצף המכיל את הסנ פ. תחל סיומת לצרף proximal ישירות SNPs ומצורפת בסיס יחיד, מסה-לאחרונה, ‘שליחות קטלנית’ משלים הסנ פ. הבסיס המחסל מונע נוסף הרחבה של ה-DNA. המסה-השינוי של הבסיס מאפשר שברי שונות על ידי בסיס יחיד שהוא זוהה על ידי ספקטרומטר מסה. הצלחת המכיל את הכימיה genotyping ואז חלה על שבב למדידה על פלטפורמה ספקטרומטר מסה. לאחר החלת המתאים פקדים איכות השיחות raw genotyping שזוהה על-ידי המערכת, הנתונים יכול להיות ייצוא ולא המשמש לניתוח סטטיסטי כדי לבדוק את הקשר עם מחלת פנוטיפים.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, נדגים את השיטה של genotyping מרובבת באמצעות ספקטרומטר מסה. התוצאות נציג נוצרו באמצעות PCR לזווג עם MALDI-TOF ספקטרומטר מסה4 בכימיה assay המופיעים בטבלה של חומרים13. עם פלטפורמה זו, יצרנו סך של 11,295 אחרים על אנשים 1,255 בגין 9 SNPs בתוך 40 h במעבדה.
אנו ממחיש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים לא תודות לך
Materials
| Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M. The candidate gene approach. Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
