Summary
Identificación de variantes genéticas que contribuyen a enfermedades humanas complejas nos permite identificar nuevos mecanismos. Aquí, demostramos un enfoque genotyping multiplex para genes candidatos o análisis de la vía genética que maximiza la cobertura a bajo costo y es favorable a los estudios de cohorte.
Abstract
Enfermedades complejas a menudo se basa en múltiples variantes genéticas comunes que contribuyen a la susceptibilidad de la enfermedad. Aquí, describimos un enfoque de polimorfismo (SNP) de un solo nucleótido etiqueta rentable usando un análisis de genotipificación multiplexados con espectrometría de masas, para investigar las asociaciones vía gene en cohortes clínicas. Investigamos el locus de candidato de alergia de alimentos Interleukin13 (IL13) como ejemplo. Este método maximiza eficientemente la cobertura mediante el aprovechamiento compartido de ligamiento (LD) dentro de una región. SNPs seleccionados de LD se diseñó en un ensayo de multiplexado, que permite hasta 40 diferentes SNP a analizar al mismo tiempo, impulsar la rentabilidad. Reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar los loci de destino, seguidos por extensión de un solo nucleótido, y los amplicones se miden mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización-tiempo de espectrometría de masas flight(MALDI-TOF). La salida se analiza con el genotipo llamada software, utilizando las definiciones de control de calidad estricto y cortes, y genotipos de alta probabilidad se determina y de salida para análisis de datos.
Introduction
En las enfermedades humanas complejas, variantes genéticas que contribuyen a la susceptibilidad de la enfermedad y cuantificar estas variantes puede ser útil para la patogenesia de la comprensión, identificar grupos de pacientes de alto riesgo y equipos de respuesta de tratamiento. De hecho, la promesa de la medicina de precisión depende utilizando información genómica para identificar subgrupos de pacientes1. Por desgracia, dentro del espacio de Biología de la enfermedad compleja, donde los fenotipos de la enfermedad se basa en la considerable heterogeneidad genética, baja penetrancia y expresividad variable, cohorte tamaño requisitos para enfoques de genoma identificar la novela los candidatos suelen ser prohibitivamente grande2. Como alternativa, un enfoque del gen candidato objetivo comienza con una hipótesis a priori sobre genes/vías específicas en la etiología de la enfermedad3. Herramientas de análisis de camino se utilizan para investigar la fisiopatología de un loci de destino identificados, generando numerosas vías de candidato a ser explorado. Aquí demostramos un enfoque genotyping multiplexado que permite la investigación de decenas o cientos de SNP con un ensayo, adecuada a cohortes humano estudios4. Este enfoque es relativamente alto rendimiento, permitiendo a cientos de miles de muestras de ADN a ser genotipados para estudios de nuevos descubrimiento y la investigación de vías específicas. Los métodos aquí descritos son útiles para identificar los alelos de riesgo y sus asociaciones con rasgos clínicos de una manera relativamente rápida y barata. Esta plataforma ha sido muy ventajosa para screening y diagnóstico propósitos5,6y más recientemente, para infección microbiana7 y8de virus del papiloma humano.
Este protocolo se inicia con la selección de un conjunto de genes para la investigación, es decir., las regiones de destino, típicamente determinadas a través de búsqueda de literatura, o hipótesis a priori por su participación en el proceso de la enfermedad; o tal vez seleccionado para la replicación como las principales asociaciones de un estudio de asociación del genoma (AGA) del descubrimiento. Desde el gen, el investigador seleccionará una lista refinada de etiqueta SNPs. Es decir, el ligamiento (LD), o correlación entre las variantes en la región se utiliza para identificar a un representante 'tag SNP' para un grupo de SNPs en alta LD, conocido como un haplotipo. El LD alta de la región significa que los SNPs a menudo heredan juntos que el Genotipado de un SNP es suficiente para representar la variación de los SNPs en el haplotipo. Como alternativa, si después de una lista definitiva de SNPs de muchas regiones, por ejemplo., la replicación de un estudio GWA, este proceso puede ser innecesario. Para genotipificación multiplexado, un ensayo entonces debe ser diseñado alrededor de estos objetivos que los cebadores de amplificación son de masa diferentes a los de los cebadores de extensión y productos para producir interpretable espectros de masas. Estos parámetros son fácilmente implementados por una herramienta de diseño de ensayo de genotipado multiplexados. Los iniciadores adelante y atrás de este diseño se utilizará a los marcadores de interés y amplificar la secuencia que contiene el SNP. Los cebadores de extensión fije directamente proximal a la SNP y se añade una base única, masa modificado, 'terminator' que es complementaria al SNP. La base de terminator evita que más extensión de la DNA. La masa-modificación de la base permite fragmentos diferentes de una única base para ser detectado por espectrometría de masas. La placa que contiene la química de genotipado se aplica a un chip para la medición en una plataforma de espectrometría de masas. Después de aplicar los controles de calidad adecuados a las llamadas de genotipado crudo detectadas por el sistema, los datos pueden exportados y utilizados para el análisis estadístico para probar la asociación con fenotipos de la enfermedad.
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Protocol
El material genético utilizado fue éticamente aprobado para uso en la oficina para niños HREC (humano investigación Comité de ética) (FCD/07/492), el Departamento de HREC de servicios humanos (10/07) y Hospital (RCH del Royal Children) HREC (27047).
1. diseñar el ensayo multiplexado
- Prepare una lista SNP para el diseño del ensayo.
- La región objetivo de entrada a la función de tagger de Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Utilice el LD (correlación, r2) entre SNPs que abarca la región objetivo para generar una lista de SNPs, que proporciona cobertura total de la región deseada con el menor número de variantes requiere. Generar una lista de SNPs que se correlacionan todos los alelos a ser capturado por encima de un umbral definido por el usuario (por ej., r2 ≥0.8).
- Identificación de secuencias adecuadas para cartillas de avance, retroceso y extensión
- Entrar en la lista de SNPs en la herramienta de diseño de análisis de elección.
Nota: Estas instrucciones se aplican a la herramienta de diseño de análisis para generar los resultados representativos, tal como se especifica en la Tabla de materiales. - Una vez que ha puesto en marcha la herramienta de diseño de análisis, seleccione Nuevo diseño de genotipificación. Introduzca un nombre para el diseño de ensayo en el campo Nombre del diseño .
- Proporcionar la lista SNP generada en el paso 1.1.1 haciendo clic en el botón Editar entrada de texto con las instrucciones de rs o FASTA a la izquierda del botón.
Nota: SNPs pueden entró como una lista de texto de referencia (rs) SNP IDs o subidos en formato FASTA o herramienta utiliza el formato de archivo de grupo de SNP. Para subir archivos en estos formatos, seleccione el botón Subir . El límite superior de las variantes que se pueden diseñar en un solo ensayo, denominado 'bien,' es 40 SNPs. Es posible especificar SNPs que son una prioridad para el diseño antes de comenzar la carrera. Estos se diseñarán primero. Control SNPs pueden especificarse: por ejemplo, se agregó un ensayo para detectar el género en el caso de la muestra mezcla ups o un control para determinar esa plantilla suficiente si se trabaja con baja o mala calidad de ADN. Sin embargo, cabe señalar que utilizando SNPs control y prioridad puede reducir el número de SNPs que puede ser diseñado en un solo bien. - En el menú preestablecido , seleccione la opción alta multiplexación iPLEX preestablecido . En el menú de organismo , seleccione el organismo del que se deriva el ADN ser genotipados. Para el representante resultados aquí presentados, este era humano.
Nota: Ratón y organismos bovinos también son compatibles con la herramienta. Uno también puede seleccionar otros si trabaja con un organismo alternativo como planta o microbio; sin embargo, los pasos automatizados para encontrar SNPs próximos y primer óptimo áreas no estará disponibles debido a la ausencia de un genoma de referencia. - En el menú base de datos , seleccione la última versión del genoma, o una acumulación alternativa si es necesario, en el menú de química . Seleccione iPLEX y para el campo Nivel de Multiplex , entrar en el más alto nivel de multiplexación: 40. Ahora, seleccione Comenzar a ejecutar. "Paso 1" de la herramienta comenzará.
Nota: En el paso 1, la herramienta recupera y formatos de las secuencias SNP. Aquí, pueden incluir errores de formato del archivo FASTA en que caso el archivo FASTA debe ser revisada y reordenada según sea necesario. Otro error es SNP rs números que se han fusionado con otro número de rs, en el cual caso el número de rs se debe buscar en una base de datos SNP como dbSNP de NCBI para identificar el nuevo número de rs SNP. Secuencias en el SNP se ha buscado cualquier SNPs próximos conocidos que pudieran interferir con el diseño de la cartilla. Sitios potenciales de la cartilla PCR se comparan con el genoma para evitar la amplificación no específica debido a múltiples golpes en el genoma. - Esperan la terminación del "Paso 2" de la herramienta de diseño en el que se identificarán los SNPs próximos.
Nota: Si utiliza un organismo que no es compatible con este paso, anotar las secuencias de SNPs próximos en anotación de IUPAC si esta información está disponible. Rara vez hay errores durante esta etapa; sin embargo, los errores pueden producirse si el organismo de referencia equivocada o genoma fue seleccionado, o secuencias de cDNA fueron introducidas en lugar de ADN genómico. Para optimizar el paso 2, bajo Configuración avanzada, es posible filtrar los SNP basado en una población si trabajan dentro de una población específica. Rara SNP también ser filtrada mediante la exclusión de aquellos con una frecuencia inferior al 1%. Finalmente, SNPs que no tienen un estatus validado o no tienen información demográfica también pueden ser excluidos si se desea. - Esperan conclusión de regiones "Paso 3" de la herramienta de diseño que identifica el primer óptimo. Si se prefiere se han identificado lugares de cartilla, o si trabaja con un organismo diferente, manualmente la entrada lugares cartilla por anotar la secuencia de entrada (los archivos de grupo SNP) con las regiones primer recomendado: en mayúscula y el resto de la secuencia en menor caso, seleccione Caso preservar desde el menú de configuración avanzada para este paso.
Nota: Errores de pasos 2 y 3 pueden incluir: (1) SNP próximo A bloqueando el diseño de una cartilla con la solución para enmascarar con una base no es de plantilla y pedir un oligo con base universal como Isonine, diseño o dos cartillas, una con cada uno de los alelos de la proxim al SNP o diseño una cartilla con el alelo común solamente. (2) otro error común es la incapacidad para identificar un sitio único para la cartilla con la solución para modificar la longitud del amplicón para identificar un sitio único. La herramienta utilizada para este trabajo, el valor predeterminado es 80-120 bp. Esto puede ser alterado de bp 60-400 en el diálogo de configuración avanzada en la configuración de longitud del amplicón en "3. Identificar áreas de Primer óptimo"y también en la pestaña de productos de"4. Diseño de ensayos". Asegúrese de que ambos se modifican. Sin embargo, cabe señalar que aumenta la longitud de los amplicones cuando uso degrada DNA no es recomendable. - Esperan finalizar la fase de diseño del ensayo (herramienta "paso 4" del diseño), aquí la herramienta tiene como objetivo proporcionar paso óptima separación entre los cebadores de extensión y los alelos de todos los SNPs en los diseños de multiplexado. Después de completar este paso, exporte el archivo orden de Oligo, que es el formato para ordenar fácil a través de un oligo pedidos proveedor de elección.
Nota: Los cebadores de amplificación (hacia adelante (F) y Reverse (R)) están diseñados para producir un tamaño de amplicón óptima de 80 a 120 bp. La cartilla de amplificación masa debe diferir de la de la cartilla de extensión y de su producto para evitar resultados contradictorios en el espectro de masas y para el rendimiento global de la PCR. La cartilla de extensión debe ser 15 a 30 nucleotides largos (Da 4.500-9.000), diseñados para que el extremo 3' se fije directamente adyacente al sitio del polimorfismo. Todos estos ajustes se establecen automáticamente en la herramienta utilizada para generar resultados representativos.
- Entrar en la lista de SNPs en la herramienta de diseño de análisis de elección.
- Exportar el diseño de los cebadores herramienta y orden elegidos de un proveedor de oligómero: 25 nmol de cada uno de los iniciadores de la polimerización en cadena (adelante y atrás) y 100 nmol de cada uno de los iniciadores de la extensión. Vea la tabla 1 para los iniciadores utilizados para generar resultados representativos.
2. genotipificación (1-2 días)
- Preparar los cebadores de amplificación.
- Si ordenaron liofilizados iniciadores, reconstituir con agua de grado molecular. Utilizar una concentración de 100 μM/μL para cartillas de avance y retroceso y 500 μM/μL para la extensión.
- Cartillas de marcha adelante y atrás de piscina para cada ensayo multiplexado en una mezcla de primer stock, que contiene cada cebador a una concentración de 0.5 mM.
Nota: por ejemplo, una piscina de cartilla de 400 μL de 400 reacciones:
2 μL de cada cebador a una concentración de 100 μM/μL, se requiere para la piscina primer stock. Para un análisis de 30-plex con 60 cartillas de avance y retroceso, un total de 120 μL de cebador sería necesaria (la piscina del primer concentrado). Agua de grado molecular de 280 μL se añadiría luego para hacer un volumen final de 400 μL de cebador de la mezcla.
- Amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
- Hacer una mezcla principal para la PCR con 100 nM de la mezcla de cartilla detallada arriba, 500 μM de dNTPs, 2 mM de MgCl2y 0.5 U de enzima polimerasa de la DNA. 1 U es necesario para mayor análisis 26-plex. Consulte la tabla 2.
- Añadir 4 μL de esta mezcla a cada pocillo de la placa PCR 384 pocillos, junto con 1 μL de ADN genómico en una concentración de 5-10 ng/μL.
Nota: controles de calidad deben incluirse también en la placa, como un control no es de plantilla y un control positivo que ha realizado previamente con el ensayo (durante una prueba de funcionamiento). Si ejecuta múltiples placas, muestras de ADN varios de la otra placa, por ejemplo., por triplicado, se debe ejecutar como controles técnicos para variabilidad inter-placas. - Centrifugar la placa a 200 x g durante 1 min a temperatura ambiente con una cubierta de la placa para asegurar todo el líquido se contiene en la parte inferior de los pocillos de la placa.
- Ejecutar la polimerización en cadena con las siguientes condiciones del termociclador: incubación de 4 min a 94 ° C para activar el ADN polimerasa; 45 ciclos de los siguientes (desnaturalización a 94 ° C por 20 s, recocido a 56 ° C para 30 s y extensión a 72 ° C por 1 min) y luego una extensión final a 72 ° C durante 3 minutos consulte el programa de PCR en la tabla 3.
- Realizar la electroforesis del gel de agarosa para que la amplificación de ADN sea exitosa. Use 1 μl del producto de PCR (con 3 μl de tampón de carga) en un gel de agarosa al 2% (w/v), hecho mezclando la agarosa en polvo y tampón de Tris borato EDTA (TBE) de 0,5% y correr por 45 min a 100 V.
- Paso de purificación de fosfatasa alcalina (SAP) de camarones
Nota: Este paso se utiliza para eliminar nucleótidos no incorporadas. La enzima SAP separa grupos de fosfato para prevenir primer exceso y sin incorporar dNTPs de interferir en la reacción de extensión próxima.- Hacer un maestro de la mezcla que contiene 1,7 unidades/μL de enzima fosfatasa alcalina camarón (SAP), buffer SAP de 10 x y completar al volumen con agua grado molecular. Consulte la tabla 4.
- Añadir 2 μL de la recién compuesta SAP master mix a cada pocillo de la placa, ya que contiene 5 μL de la reacción de PCR. Centrifugar brevemente y volver al termociclador a 37 ° C durante 40 minutos y luego a 85 ° C durante 5 minutos para la inactivación de la enzima. Consulte la tabla 5.
- Reacción de extensión de la cartilla
Nota: La concentración de los cebadores de extensión en la mezcla de la cartilla de extensión debe ajustarse por tamaño (Primer ajuste lineal – LPA). Esto es porque hay una relación inversa en la intensidad de pico (en los espectros de masas) y producto total. Ajuste de la concentración del primer extensión corrige esta relación producir picos de intensidades iguales. Ajustar cartillas para generar al representante resultados se ofrecen en las tablas 6 y 7. Los volúmenes proporcionados son generar 1,5 mL de la mezcla de la cartilla de extensión.- Calcular factores de dilución para cada cartilla mediante un algoritmo de gradiente, de Agena Biosciences ('Primer ajuste lineal'), que se ajusta para la masa y la concentración de la cartilla y el número total de cartillas en la reacción multiplexada (véase Cuadros 6 y 7). Introduzca la masa de la UEP para cada cartilla en el campo UEP_MASS de la hoja de ajuste lineal de la cartilla.
Nota: La concentración de masa ajustada para la imprimación se calculan automáticamente en la celda con el texto del encabezado «Destino reacción concentración (μm).» El volumen de la cartilla que se añade a la piscina de la cartilla se producirá en la célula bajo el texto del encabezado "Volumen Stock cartilla para ser añadido a la piscina (μL)." La salida del volumen de agua que se añade a la piscina de la cartilla para las concentraciones calculadas a la celda al lado del texto "volumen de PCR grado Rnasa H libres2O ser añadido Primer piscina (μL)". - Tomar el volumen de cada cartilla según se especifica en el archivo de ajuste lineal de la cartilla y hacer una piscina de cartilla. Añadir el volumen de agua calculado por el algoritmo para diluir la piscina cartilla según lo determinado en el paso 2.4.1.
Nota: Si el método del gradiente algoritmo está disponible, otro método es dividir los iniciadores en alta masa y baja masa y añadir el doble de la concentración de los cebadores de masa alta en relación con el grupo de masa baja. Grupos de tres o cuatro pueden ser necesarios para un análisis de alto-plex (es decir, más de 19 SNPs). Sin embargo, este método no dará como tarifas óptimas como el método del gradiente algoritmo. - Montar la mezcla principal de extensión. Para el análisis de plex baja (plex de 1-18), agregar 0,2 μL de tampón, 0.1 μL de mezcla de terminación, 0.94 μL de la mezcla de la cartilla LPA ajustado y 0,0205 μL de enzima (preparado en el hielo). Para el análisis de plex alta (19-36 plex), añadir doble concentración de la mezcla de terminación y enzima (terminación mezcla 0,2 μL y iPLEX μL de enzima 0,041). Refiérase a Tabla 8.
- Añadir 2 μL de la mezcla principal de reacción de extensión a la placa de la reacción anterior, ya que el volumen total 9 μL por pocillo. Centrifugar brevemente y coloca en el termociclador: 94 ° C durante una incubación inicial 30 de s, 40 ciclos de 1 x 94 ° C durante 5 s x 5 (52 ° C durante 5 s, seguido de 80 ° C por 5 s) y luego de 72 ° C durante 3 minutos consulte la Tabla 9.
- Calcular factores de dilución para cada cartilla mediante un algoritmo de gradiente, de Agena Biosciences ('Primer ajuste lineal'), que se ajusta para la masa y la concentración de la cartilla y el número total de cartillas en la reacción multiplexada (véase Cuadros 6 y 7). Introduzca la masa de la UEP para cada cartilla en el campo UEP_MASS de la hoja de ajuste lineal de la cartilla.
- Purificación de la resina.
Nota: Sales de exceso pueden ahora extraerse la reacción con el uso de la resina.- Añadir 16 μL de agua desionizada en los pocillos de la placa obtenido, que el volumen de la placa hasta 25 μL.
- Aplique la resina, generalmente de 6 mg de resina placa (se compra por separado), uniformemente a la placa entera. Dejar la resina se seque en la placa de resina por 20 min a temperatura ambiente antes de aplicar a la placa de reacción. Después de la adición de la resina, gire la placa por 5 min a temperatura ambiente ya sea a mano o con una mezcladora de suspensión a baja velocidad (por ej., 7,5 rpm).
Nota: Antes de cargar el analito de genotipificación en el chip de genotipado, las muestras y el ensayo deben ser de entrada en la interfaz del software. Esto puede lograrse mediante el archivo de Resumen de diseño de la herramienta de diseño de ensayo.
- Medición en una plataforma de espectrometría de masas.
- Centrifugar la placa a 3.200 x g durante 5 min evitar la aplicación de la resina para el chip de espectros de masas.
- Subir el diseño de la placa de muestras con interfaz de software del sistema antes de la carrera.
Nota: Paso 2.6.3 debe realizarse sólo por personal enseñado. - Aplique la mezcla de analitos genotyping de la placa al chip de genotipado con un sistema de dispensación. A continuación, cargar el chip en el sistema MALDI-TOF para generar los espectros de masa de la mezcla de analitos, que luego puede ser interpretada con la ayuda de la interfaz de la plataforma.
Nota: El sistema genera los espectros de masas dirigiendo pulsos cortos de luz UV en cada 'pad', correspondiente a un único pozo de la placa de genotipificación, de la viruta de espectros de masas. Este pulso resulta en la desorción y la ionización del analito. Estas ionizan DNA las moléculas entonces se propulsan a la parte superior del tubo de vacío por un campo electrostático de alta tensión, separar los iones más ligeros, que viajan más rápido y llegar en primer lugar, el detector de iones más pesados. El "tiempo de vuelo" de estos analitos es registrado por el sistema, de los cuales puede determinarse la masa de cada fragmento de ADN y así la base de nucleótidos presente en el SNP puede ser deducida.
3. genotipificación datos
Nota: control de calidad y la interpretación de los datos no son el foco de este trabajo de metodología. Sin embargo, a continuación brevemente cubrirá interpretación de los espectros de masas.
- Manual inspección y control de calidad de espectros de masas.
Nota: Los espectros de masa crudos generados por el sistema y analizados con el software que se enumeran en la Tabla de materiales. Una mezcla gaussiana método de clustering se aplica a esta salida para hacer llamadas de genotipado probabilístico.- Abra el software de análisis. Seleccione el analizador Typer. En el menú archivo , seleccione Abrir pozos de archivo y seleccione el archivo xml con los datos del espectro generados en el paso 2.6.3. El nombre de chip para la carrera debe ser visible, seleccionarlo y se mostrará un panel de "semáforo" de la placa de 384 pozos con una lista de los SNPs en los seleccionados bien. Desde aquí, seleccione Llamada Cluster parcelas para ver un diagrama de dispersión de puntos de datos para cada SNP.
Nota: Se recomienda aplicar un resultado 'no llame' de baja intensidad SNPs. En el software utilizado para obtener resultados representativos, clustering magnitud corte de 5, que es superior de forma predeterminada, se sugiere para control de calidad estricto. Esta configuración se puede ajustar en el campo de corte de magnitud bajo los parámetros en el panel de Clusters de procesamiento de Post . Seleccione Autocluster de la ficha herramientas para realizar un análisis de cluster. - Realizar una inspección manual de llamadas genotipo examinando las parcelas cartesianos en el panel de Post procesamiento. En el panel de análisis, seleccione el SNP de interés y haga clic en la ficha de Post-Processing Clusters , una parcela de cluster con genotipo agrupamiento será visible con ID de muestra y correspondientes genotipos de SNP.
- Examinar los grupos de llamada genotipo y evaluar qué tan bien cada llamada individual clusters con las otras llamadas SNP. El software proporciona algunas líneas de límite de la parcela para cada genotipo de orientación; ver ejemplo de un genotipo llamadas cluster solar de un IL13 SNP (figura 1). Si la llamada no se agrupan estrechamente con otras llamadas y se sienta claramente fuera de un clúster, o si tiene muy baja intensidad, haga clic con el botón derecho la datapoint y seleccione Cambio llame para ajustar manualmente al No llamar.
- Para asegurar datos de genotyping de alta calidad se utilizan para análisis posteriores, excluir SNPs y personas con tarifas por debajo de un umbral de control de calidad, por ejemplo, 90%. Una vez que haya hecho los ajustes adecuados a los datos de llamada, exportar los datos de aplicaciones estadísticas. En el software utilizado para generar los resultados representativos (listados en la Tabla de materiales), esto se logra con la selección de Datos de la placa desde el menú Ver y seleccionando Guardar como.
- Abra el software de análisis. Seleccione el analizador Typer. En el menú archivo , seleccione Abrir pozos de archivo y seleccione el archivo xml con los datos del espectro generados en el paso 2.6.3. El nombre de chip para la carrera debe ser visible, seleccionarlo y se mostrará un panel de "semáforo" de la placa de 384 pozos con una lista de los SNPs en los seleccionados bien. Desde aquí, seleccione Llamada Cluster parcelas para ver un diagrama de dispersión de puntos de datos para cada SNP.
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Representative Results
Con el protocolo descrito anteriormente, se genotipificaron etiqueta SNPs en el gen inmune Th2 IL13 en una cohorte de alergia de alimentos casos y controles9. Se aplicó análisis de regresión logística, ajustado por ascendencia y otras covariables potenciales probar si las variantes genéticas dentro de la región de interés aumentaron riesgo de alergia alimentaria. Tabla 10 9 demuestra que una variante rs1295686 se asocia con alergia probada en desafío y confirmamos multiplexado de esta asociación en una cohorte de replicación usando el mismo método de genotipificación. Un metanálisis de los resultados de las dos cohortes proporcionan fuerte evidencia de Asociación de IL13 con FA (tabla 11)9. Genéticamente deducida y ajustado para la ascendencia en el análisis con panel informativo de marcador SNP en una ascendencia, adaptado de un panel publicado10. Se genotipificaron multiplexado en el panel usando el mismo ensayo de enfoque.
La variante asociada, rs1295686, ha sido previamente identificada como un riesgo de asma loci11 y asociado a otros parámetros inmunológicos alérgica12, sugiriendo que puede ser un loci de riesgo general de enfermedad alérgica. Los pasos sería realizar estudios adicionales, tales como el análisis de expresión diferencial, mapeo de interacciones físicas con un método de captura de cromatina, fina cartografía de la región, y el análisis del haplotipo, para fijar la variante funcional y caracterizar la biología detrás de la asociación observada con alergia alimentaria.
Figura 1: parcela de cluster cartesiano para la IL13 SNP rs1295686. Racimos amarillos representan llamadas genotipo homocigótico para el alelo A, azul para el alelo G y verde para las llamadas heterozigóticas. El algunas llamadas de genotipo que no agrupan con los espectros totales sea homocigotos o heterocigotos se establecieron en "ninguna llamada".
Tabla 1: Secuencias de la cartilla para generar resultados representativos para IL13. La columna de nombre contiene el identificador de la SNP, el número bien (como se mencionó anteriormente, el número "bien" se refiere a la identificación del ensayo multiplexada) y el tipo de cartilla (F para adelante, R para el reverso y UEP para la cartilla de extensión). Las columnas siguientes contienen la secuencia de la cartilla, el tamaño de la cartilla y el tipo de purificación. Cabe señalar que un panel de marcadores informativos ancestro (AIM) y SPINK5 genotyped usando el mismo ensayo aunque no se discuten estos resultados con los resultados presentados del representante. SNPs en _CEU y _CHB se refieren a SNPs de objetivo para los europeos del norte de Utah y el chino de Han en poblaciones de Beijin, China del proyecto 1000 genomas respectivamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Master Mix | Plex baja (≤26 SNPs) | Plex alta (> 26 SNP) | |||
| Reactivo de | Concentrado en 5 μl | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Agua (desionizada) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Tampón de | 1 × (2 mM de MgCl2) | 0.5 | 100 | 0.5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0.4 | 80 | 0.4 | 80 |
| dNTPs | 500 ΜM | 0.1 | 20 | 0.1 | 20 |
| Primer mix ** | 100 nM | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq polimerasa | 0.5 U / 1 U | 0.1 | 20 | 0.2 | 40 |
| Total | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| ** ya diluido con desionizada H20 como se detalla en 2.1.2 | |||||
Tabla 2: los reactivos y las concentraciones requeridas para hacer la cartilla de PCR amplificación mezclar. Los volúmenes de la mezcla principal se dan para 200 reacciones porque 400 (suficiente para cubrir una placa de 384 pozos) no caben en un tubo de 1,5 μl y así debe hacerse 2 x 200 en tubos separados. Volúmenes especificados en Plex baja deben utilizarse si el ensayo multiplexado "bien" contiene menor o igual a 26 SNP, si mayor que 26 SNPs son en el uso bien el Plex altos volúmenes.
| Condiciones del termociclador |
| 94 ° C por 4 min. |
| 45 ciclos de (94 ° C 20 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 1 min) |
| 72 ° C durante 3 min. |
| Espera de 4 ° C |
Tabla 3: Condiciones de Termociclador para la PCR de amplificación.
| Master Mix | × 1 | × 410 |
| Agua (desionizada) | 1.53 | 627.3 |
| tampón 10 x | 0.17 | 69.7 |
| Enzima SAP (1.7 U/μL) | 0.3 | 123 |
| Total | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabla 4: reactivos y las concentraciones de la mezcla principal para la reacción de SAP. Volúmenes de mezcla principal se dan reacciones 410 cubrir una placa de 384 pozos con un margen de error de pipeteo.
| Condiciones del termociclador |
| 37 ° C por 40 min. |
| 85 ° C durante 5 min. |
| Espera de 4 ° C |
Tabla 5: Termociclador las condiciones requeridas para la reacción de SAP.
| # | Cebadores de extensión | Concentración stock original (μm) | Misc. | MASA DE UEP_ | Objetivo reacción concentración (μm) | EXT la cartilla piscina concentración (μm) | Cartilla de Stock volumen a agregar a la piscina (μL) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5,36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19,82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0.707 | 6,77 | 20.30 horas | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6,93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7: 30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7.89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8.03 | 24.10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0,888 | 8.50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8.69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26.50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9.03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9,32 | 27.95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9.56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9.57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9.72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10.71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10,72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10,87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10.97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11,64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11,71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11.80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1,240 | 11.87 | 35.62 | |
| Volumen de PCR grado Rnasa free H2O ser añadido Primer piscina (μL) | 561.78 | ||||||
Tabla 6: bien 1 cartillas ajustado para generar resultados representativos. Una tabla de cebadores de extensión ajustado por tamaño, incluyendo la concentración objetivo, el volumen utilizado en la piscina de la cartilla y la concentración final de cada cartilla en la piscina de cartilla para pozo 1. El volumen de agua necesaria para completar hasta el volumen final se proporciona en la parte inferior de la tabla. El volumen total de la piscina de la cartilla fue de 1,5 mL.
| # | Cebadores de extensión | Concentración stock original (μm) | Misc. | MASA DE UEP_ | Objetivo reacción concentración (μm) | EXT la cartilla piscina concentración (μm) | Cartilla de Stock volumen a agregar a la piscina (μL) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5.63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6.52 | 19,57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20,48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0,860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8.69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9.72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9.85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10.49 | 31.47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10.73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33,26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| Volumen de PCR grado Rnasa free H2O ser añadido Primer piscina (μL) | 899.42 | ||||||
Tabla 7: bien 2 cartillas ajustados para generar resultados representativos. Una tabla de cebadores de extensión ajustado por tamaño, incluyendo la concentración objetivo, el volumen utilizado en la piscina de la cartilla y la concentración final de cada cartilla en la piscina de la cartilla para el bien 2. El volumen de agua necesaria para completar hasta el volumen final se proporciona en la parte inferior de la tabla. El volumen total de la piscina de la cartilla fue de 1,5 mL.
| Master Mix | Plex baja (1-18) | Plex alta (19-36) | ||
| Reactivo de | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Agua (desionizada) | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| Tampón de | 0.2 | 82 | 0.2 | 82 |
| Mezcla de terminación | 0.1 | 41 | 0.2 | 82 |
| Mezcla de cartilla (LPA ajustado) | 0.94 | 385.4 | 0.94 | 385.4 |
| iPLEX enzima * | 0.0205 | 8.405 | 0,041 | 16.81 |
| Total | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabla 8: reactivos y las concentraciones de la reacción de extensión master mix. En este caso los volúmenes para las reacciones de baja-Plex puede usarse si hay 18 o menos SNPs en el pozo. De 19 o más SNPs utilizar Plex alta reacciones volúmenes. Esto es diferente a los requisitos del SNP de plex baja y alta-plex del amplificación PCR master mix detallado en la tabla 2.
| Condiciones del termociclador |
| 94 ° C por 30 s |
| 40 ciclos (94 ° C 5 s, (5 ciclos de 52 ° C 5 s, 80 ° C 5 s)) |
| 72 ° C durante 3 min. |
| Espera de 4 ° C |
Tabla 9: Termociclador condiciones para la reacción de extensión
| Casos de alimento alérgico alérgico controles de vs no alimentarios | |||||
| SNP | A1 | P | O | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0.003 | 1.75 | 1.2 | 2.53 |
| rs2243297 | A | 0.13 | 2.1 | 0,8 | 5.51 |
| rs1295687 | G | 0.19 | 1.63 | 0,78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0.22 | 1.45 | 0,8 | 2.64 |
| rs1295683 | T | 0.25 | 1.32 | 0,82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0.51 | 1.21 | 0.69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0.51 | 1.19 | 0,7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0.6 | 1.11 | 0.75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0.62 | 1.1 | 0.75 | 1.6 |
Tabla 10: Variante rs1295686 de la IL13 locus se asocia con alergia probada reto. Análisis de regresión logística, ajustado de ascendencia, sexo y presencia de eccema atópico, reveló esa variante rs1295686 se asocia con desafío probado alergia alimentaria en la cohorte de descubrimiento (n = 367 casos y controles no alérgica 156). La columna SNP listas los marcadores que se examina, la columna A1 muestra el alelo menor, utilizado como el alelo de referencia para la prueba de asociación. La columna P enumera los valores de P a partir del análisis de regresión, la columna OR enumera los correspondientes odds-ratios y L95 y U95 son los límites inferiores y superiores del intervalo de confianza de 95% a partir del análisis. Datos reproducen de Ashely et al., 20179.
| A. Análisis de replicación de: alimento alérgico casos alérgica controles de vs no alimentarios | B.-análisis del Meta – descubrimiento y replicación | ||||||||||
| SNP | A1 | O | L95 | U95 | P | P | REINICIO | O | OR(R) | Q | Me |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1.82 | 0.03 | 0.0005 | 0.0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1.78 | 0,7 | 0.3 | 0.3 | 1.24 | 1.24 | 0.38 | 0 |
Tabla 11: Replicación en una población independiente confirma la asociación entre IL13 rs1295686 variante y alergia probada reto. Regresión logística, corregida por componentes principales de ascendencia, sexo y eczema atópico, en una población independiente (n = 203 casos alergia alimentaria y controles no alérgica 330) confirmaron la asociación entre la variante rs1295686 y alergia alimentaria. Meta análisis se realizó entonces, proporcionando el máximo nivel de evidencia para una asociación entre el SNP y el resultado, con poca evidencia de heterogeneidad en tamaños entre las dos poblaciones en este SNP. Aquí las columnas según la tabla 10, con reinicio adicional y valores OR(R) para el metanálisis de efectos aleatorios modelo vs el modelo de efectos fijos (P y o). Q ya son el P-value para la prueba de Cochrane y el índice respectivamente, ambas son medidas de la heterogeneidad en el tamaño del efecto entre los estudios. Datos reproducen de Ashely et al., 20179.
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Discussion
Aquí, demostramos que el método de multiplexado genotipado mediante espectrometría de masas. Se obtuvieron los resultados representativos mediante PCR con MALDI-TOF espectrometría de masa4 con química de ensayo enumerados en la Tabla de materiales13. Con esta plataforma, hemos generado un total de 11.295 genotipos en 1.255 personas para 9 SNPs dentro de 40 h en el laboratorio.
Nos ilustran la utilidad de la técnica en contestar hipótesis genéticas mediante la generación y análisis de datos SNP del gen candidato IL13 en una cohorte de descubrimiento clínico fenotipada para alergia alimentaria y con replicación independiente. La plataforma es relativamente robusta a baja calidad de ADN y requiere un mínimo material de partida, una entrada de sólo 10 ng. Pasos críticos en el protocolo son las siguientes: cuidado de solución de problemas el análisis proceso de diseño para garantizar la máxima inclusión de SNP en los ensayos multiplexados, exitosa amplificación de las regiones de destino durante la amplificación PCR, solo éxito extensión de nucleótidos durante la reacción de extensión y la carga de la disposición de la placa de ensayo y muestra en el software de análisis de orden para el software asignar con precisión los datos de espectros de masas.
Como se mencionó anteriormente, la herramienta de diseño de análisis es compatible con el uso de ratón y polimorfismos bovinas, además al ser humano. Para otros organismos como planta o microbio, "otro" puede seleccionarse en el menú de "Organismo". Sin embargo, los pasos automatizados para encontrar SNPs proximal e identificar áreas de primer óptimo no estará disponibles.
Durante el proceso de diseño, si un SNP proximal que bloquea la identificación de un área de primer óptimo, uno puede eliminar el SNP desde el diseño y seleccione otro en el LD alta (por ejemplo, r2 = 1), o elegir dos cartillas, una con la referencia de diseño alelo del SNP y con el alelo alternativo, diseñando una cartilla con el alelo común o enmascarar el SNP con una base universal (p. ej., inosina). Si hay un problema con la identificación de un sitio único para la cartilla, uno puede cambiar la posición de longitud del amplicón para encontrar un sitio único. El valor predeterminado es 80-120 bp pero esto puede modificarse de bp 60-400. Sin embargo, debe señalarse que si se trabaja con ADN degradado (por ejemplo, del tejido FFPE), no es ideal para aumentar la longitud del amplicón.
Errores durante la etapa de diseño de análisis de la herramienta pueden incluir horquilla alta o el dímero de primer potencial. Ambos ajustes pueden estar relajados intentar un acomodar los diseños. Sin embargo, se recomienda que los umbrales no se relajan debajo de 0.8; comenzar con 0.9 a ver si esta configuración es suficiente para rescatar el SNPs y reducir a 0,8 sólo si es necesario. En la configuración avanzada, es posible cambiar el número de iteraciones de diseño (hasta 10) en la pestaña múltiplex de "4. Diseño de ensayos", así como los mejores criterios de selección de iteración Multiplex promedio más alta o Menor rechaza por Plex baja. Aumentar el número de iteraciones de diseño puede ser ventajoso porque la herramienta tendrá el primer SNP en el orden que se proporcionaron y diseñarán un ensayo. Luego prueba si el SNP próximo es compatible para el mismo ensayo multiplex. Así, la orden de la materia de SNP. Con múltiples iteraciones seleccionada la opción, el software de aleatorizar el orden de los SNPs y probar otras iteraciones. Esto puede aumentar el número de SNPs puede ser diseñado en cada múltiplex o disminuya el número de rechazos SNP. Sin embargo, también vendrá a un costo de tiempo, como la herramienta de diseño se llevará mucho más tiempo en este paso.
Genotipado de multiplexado es un enfoque rápido y asequible para la investigación de los loci de interés. El método se optimiza y permite el funcionamiento de aproximadamente 760 muestras de hasta 40-plex SNPs en 10 horas, permitiendo decenas de miles de genotipos que se generen en menos de un día14. Los espectros de masas pueden ser fácilmente analizados con herramientas proporcionadas por la plataforma.
Algunas restricciones a la plataforma incluyen una pérdida estimada de 5-10% de los SNPs que fracase el proceso de diseño del ensayo. A veces esto puede ser corregido por la selección de una etiqueta alternativa o proxy SNP. La base de datos de anotación de SNP del Instituto Broad y búsqueda de Proxy (SNAP) es una herramienta que facilita la identificación de SNPs15de proxy. Otra limitación del sistema es que es una plataforma de destino y por lo tanto no permite el descubrimiento de novela extensa, como con enfoques de genoma. Además, como el enfoque utiliza a proxies tag-SNP para maximizar la cobertura a través de genes, mapeo fino pueden posteriormente se necesitan estudios para determinar la variante causal precisa.
Genotipado de multiplexado sigue siendo una plataforma útil para el interrogatorio de la enfermedad asociada SNPs identificados en GWA estudio planteamientos o hipótesis por candidato y camino de la exploración del gene. Futuras aplicaciones para la plataforma están probables que nuevos usos para el diagnóstico y la investigación en campos como el cáncer y virología clínica. General genotyping multiplexado con espectrometría de masas es un método de mediano rendimiento rápido, rentable y confiable para loci candidatos de genotipificación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
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