Kandidat Gene tester i klinisk kohortstudier med multiplexade genotypning och masspektrometri
Summary
Identifiering av genetiska varianter bidrar till komplexa mänskliga sjukdomar tillåter oss att identifiera nya mekanismer. Här visar vi ett multiplex genotypning förhållningssätt till kandidatgener eller gen väg analys som maximerar täckning till låg kostnad och är mottagliga för kohort-baserade studier.
Abstract
Komplexa sjukdomar bygger ofta flera vanliga genetiska varianter som bidrar till sjukdom mottaglighet. Här beskriver vi en kostnadseffektiv tagg single nucleotide polymorphism (SNP) strategi med en multiplexade genotypning analys med masspektrometri, för att undersöka gen väg föreningar i kliniska kohorter. Vi undersöker det mat allergi kandidat locus Interleukin13 (IL13) som exempel. Den här metoden maximerar effektivt täckning genom att utnyttja delade linkage disequilibrium (LD) inom en region. Valda LD SNP är sedan utformade i en multiplex assay, möjliggör upp till 40 olika SNP analyseras samtidigt, öka kostnadseffektiviteten. Polymeras-kedjereaktion (PCR) används för att förstärka de målet loci, följt av enda nukleotid förlängning, och amplikoner mäts sedan med hjälp av matris-assisted laser desorption och jonisering-tid för flight(MALDI-TOF) masspektrometri. Råa utdata analyseras med genotypen att kalla programvara, använda sträng kvalitetskontroll definitioner och cut-off och hög sannolikhet genotyper bestäms och utgång för dataanalys.
Introduction
I komplexa sjukdomar hos människan, genetiska varianter bidrar till sjukdom mottaglighet och kvantifiera dessa varianter kan vara användbara för förståelsen patogenes, identifiera patientgrupper med hög risk, och behandling responders. Löftet om precision medicin är faktiskt beroende av att utnyttja genomisk information för att identifiera patientundergrupper1. Tyvärr inom komplex sjukdom biologi utrymmet, där sjukdomen fenotyper stöds av betydande genetisk heterogenitet, låg penetrans och variabel expressivitet, kohort storlek krav för genome-wide metoder att identifiera roman kandidaterna är ofta oöverkomligt stor2. Alternativt börjar en riktad kandidat gene strategi med en förhand hypotes om specifika gener/vägar i sjukdom etiologi3. Väg analysverktyg används ofta att undersöka patofysiologin bakom en identifierade målet loci, genererar många kandidat vägar att utforska. Här visar vi en multiplexade genotypning strategi som ger för utredning av tiotals till hundratals SNP med en analys, anpassade till människans kohort studier4. Detta synsätt är relativt hög genom-sätt, tillåter hundratals till tusentals DNA-prover vara genotypbestämts för roman upptäckten studier och utredningar av specifika vägar. De metoder som beskrivs här är användbara för att identifiera risk alleler och deras sammanslutningar med kliniska drag på ett relativt snabbt och billigt sätt. Denna plattform har varit mycket fördelaktigt för screening och diagnostiska ändamål5,6, och mer nyligen, för mikrobiell infektion7 och humant papillomvirus8.
Detta protokoll börjar med urval av en uppsättning gener för undersökningen, dvs., målregionerna, vanligtvis bestäms genom litteratur du söker, eller förhand hypoteser för inblandning i sjukdomsprocessen; eller kanske valda för replikering som ledande sammanslutningar av en upptäckt genome-wide association (GWA) studie. Från gen uppsättningen väljer forskaren en förfinad lista med etiketten SNP. Det vill säga är den linkage disequilibrium (LD), eller korrelation, bland varianter i regionen används för att identifiera en representant ‘tag SNP’ för en grupp av SNP i höga LD, känd som en haplotyp. Högt LD i regionen innebär att SNP ofta ärvs tillsammans så att genotypning en SNP är tillräcklig för att representera variationen på alla SNP i haplotypen. Alternativt, om följande på en slutgiltig lista av SNP från många regioner, t.ex., replikering för en GWA studie, denna process kan vara onödigt. Multiplexade genotypning, måste ett test sedan utformas runt dessa mål så att förstärkning primers av olika massa med förlängning primers och produkter att producera tolkningsbara massa spectra. Dessa parametrar genomförs enkelt av ett multiplexade genotypning analys designverktyg. Framåt och bakåt primers från denna design används för att rikta markörerna av intresse och förstärka den sekvens som innehåller SNP. Förlängning primers bifoga direkt proximalt SNP och en enda, massa modifierade, ‘terminator’ base som är ett komplement till SNP läggs. Terminator basen förhindrar ytterligare förlängning av DNA. Mass-ändring av basen kan fragment skiljer sig genom en enda bas att upptäckas av masspektrometri. Plattan innehåller genotypning kemi tillämpas sedan på ett chip för mätning på en masspektrometri plattform. Efter tillämpa lämpliga kvalitetskontroller på raw genotypning samtal detekteras av systemet, kan data exporteras och användas för statistisk analys för att testa om associering med sjukdom fenotyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi metoden för multiplexering genotypning med masspektrometri. De representativa resultat genererades med PCR parat med MALDI-TOF masspektrometri4 med assay kemi som förtecknas i Tabell av material13. Med den här plattformen genererat vi totalt 11,295 genotyper 1 255 enskilda för 9 SNP inom 40 h i labbet.
Vi illustrera nyttan av tekniken i svara genetiska hypoteser genom att generera och analysera SNP data för kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M. The candidate gene approach. Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
