Identifikasjon av genetisk varianter bidra til komplekse menneskelig sykdom tillater oss å identifisere romanen mekanismer. Her viser vi en multiplex genotyperingteknologi tilnærming til kandidat gener eller genet sti analyse som maksimerer dekningen til lav pris og er mottakelig for kohort-baserte studier.
Komplekse sykdommer er ofte understøttet av flere vanlige genetisk varianter som bidrar til sykdom mottakelighet. Her beskriver vi en kostnadseffektiv tag single nukleotid polymorfisme (SNP) tilnærming med en multiplex genotyperingteknologi analysen massespektrometri, undersøke genet veien foreninger i klinisk kohorter. Vi undersøker mat allergi kandidat locus Interleukin13 (IL13) som et eksempel. Denne metoden maksimerer effektivt dekning ved å utnytte delte sammenhengen ulikevekt (LD) innenfor et område. Valgte LD SNPs deretter utformes i en multiplex analysen, slik at opptil 40 forskjellige SNPs skal analyseres samtidig øke kostnadseffektivitet. Polymerasekjedereaksjons (PCR) brukes til å forsterke målet loci, etterfulgt av single nukleotid utvidelse, og amplicons er deretter målt ved hjelp av matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-tid av flight(MALDI-TOF) massespektrometri. Rå produksjon er analysert med genotype ringe programvare, med streng kvalitetskontroll definisjoner og avskjær, og høy sannsynlighet genotyper er bestemt og for dataanalyse.
I menneskelige komplekse sykdom, genetisk varianter bidrar til sykdom mottakelighet og kvantifisere disse variantene kan være nyttige for forståelsen patogenesen, identifiserer pasienten høyrisikogrupper og behandling respons. Løftet om presisjon medisin er faktisk avhengig utnytte genomisk informasjon for å identifisere pasienten undergrupper1. Dessverre innen komplekse sykdom biologi, der sykdommen fenotyper er understøttet av betydelig genetisk heterogenitet og lav penetrance variabel expressivity, kohort størrelse krav for genomet hele tilnærminger til å identifisere roman kandidater er ofte prohibitively store2. Alternativt begynner en målrettet kandidat genet tilnærming med en en priori hypotese om bestemte gener/stier i sykdom etiologi3. Sti analyseverktøy brukes vanligvis til å undersøke i Patofysiologien ved en identifiserte målet loci, genererer mange kandidat stier å bli utforsket. Her viser vi en multiplex genotyperingteknologi tilnærming slik at etterforskningen av titalls til hundrevis av SNPs med ett analysen, egnet til menneskelig kohort studier4. Denne tilnærmingen er relativt høy lakkeringsverksteder, tillater hundrevis til tusenvis av DNA-prøver å være genotyped for romanen oppdagelsen studier og undersøkelser av bestemte stier. Metodene som er nevnt her er nyttig for å identifisere risiko alleler og tilknytning med klinisk trekk i en relativt rask og billig måte. Denne plattformen er svært fordelaktig for sortering og diagnostiske formål5,6, og mer nylig for mikrobielle infeksjoner7 og humant papillomavirus8.
Denne protokollen begynner med valg av gener for etterforskning, dvs., regionene mål, typisk fastsettes gjennom litteratur søker, eller en priori hypoteser for engasjement i sykdommen prosessen; eller kanskje valgte for replikering som ledende sammenslutninger av en oppdagelse genomet hele association (GWA) studie. Fra Gen sett velge forskeren en raffinert over koden SNPs. Dvs brukes den sammenhengen ulikevekt (LD) eller korrelasjon mellom varianter i regionen til å identifisere en representant “tag SNP” for en gruppe med SNPs i høy LD, kjent som en haplotype. Den høye LD i regionen betyr at SNPs er ofte arvet sammen slik at genotyperingteknologi en SNP er tilstrekkelig til å representere variasjonen på alle SNPs i haplotype. Alternativt, hvis følger på en endelig liste med SNPs fra mange områder, f.eks., replikering for en GWA studie, denne prosessen kan være unødvendig. For multiplex genotyperingteknologi, må analysen deretter være utformet rundt disse målene slik at forsterkningen primerne er ulik masse de forlengelsen primerne og produkter å produsere interpretable masse spectra. Disse parameterne er lett implementert av en multiplex genotyperingteknologi analysen design verktøyet. Revers primerne fra denne designen brukes til målet markører av interesse og forsterke sekvensen som inneholder av SNP. Utvidelse primerne knytte direkte proksimale til SNPs og en enkelt, masse endring, “terminator”-base som er komplementære til av SNP er lagt. Terminator basen forhindrer ytterligere utvidelse av DNA. Masse-endring av basen kan fragmenter ulike av én base kan oppdages av massespektrometri. Platen inneholder genotyperingteknologi kjemi brukes deretter til en chip for måling på en massespektrometri plattform. Etter bruker riktig kvalitetskontroll rå genotyperingteknologi samtaler registrert av systemet, kan dataene eksporteres og brukt til statistisk analyse for å teste for tilknytning sykdom fenotyper.
Her viser vi metoden multiplex genotyperingteknologi bruker massespektrometri. Representant resultatene ble generert bruker PCR sammen med MALDI-TOF massespektrometri4 med analysen kjemi oppført i Tabell for materiale13. Med denne plattformen generert vi totalt 11,295 genotyper på 1,255 individer for 9 SNPs innen 40 timer i laboratoriet.
Vi illustrerer nytten av teknikken med å besvare genetisk hypoteser ved å generere og ana…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen takk.
Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
Micropipettes | single and 8-channel | ||
Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
Plate rotator | |||
MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |