Определение генетических вариантов, способствующих сложных заболеваний человека позволяет нам выявить новых механизмов. Здесь мы продемонстрировать мультиплекс генотипирования подход к кандидату генов или гена путь анализа, который максимизирует покрытия при низких затратах и поддается на основе когортных исследований.
Сложные заболевания часто подкрепляются несколько общие генетические варианты, которые способствуют восприимчивость к болезням. Здесь мы описываем экономически тег единичных нуклеотидных Однонуклеотидный полиморфизм подход с использованием мультиплексных генотипирования пробирного с масс-спектрометрии, расследовать ген путь ассоциаций в клинической когорт. Мы исследуем пищевой аллергии кандидат Локус Interleukin13 (IL13) в качестве примера. Этот метод эффективно увеличивает охват, воспользовавшись общих связей неравновесия (LD) в пределах региона. Выбранный LD ОНП затем предназначены в мультиплексированных пробирного, позволяя до 40 различных SNPs анализируемым одновременно, повышение эффективности затрат. Полимеразной цепной реакции (ПЦР) используется для усиления целевой локусов, следуют единичных нуклеотидных расширение, и ампликонов затем измеряются с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время flight(MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Необработанный вывод анализируется с генотипом, программного обеспечения, используя определения строгого контроля качества и обрезков, и высокой вероятностью генотипов, определяются и выход для анализа данных.
В сложных заболеваний человека генетических вариантов способствуют восприимчивость к болезням и количественной оценки этих вариантов могут быть полезны для понимания патогенеза, выявление пациентов группы высокого риска и лечение ответчиков. Действительно обещание медицины точности зависит от использования геномной информации для выявления больного подгруппы1. К сожалению в сложное заболевание биологии пространстве, где болезнь фенотипов подкрепляются существенной генетической гетерогенностью, низкой пенетрантностью и переменной экспрессивность, когорты размер требования для генома общесекторальных подходов к идентификации Роман кандидаты, часто чрезмерно большой2. Кроме того подход гена целевых кандидата начинается с априори гипотезы о конкретных генов/путей в этиологии болезней3. Инструменты анализа пути обычно используются для изучения патофизиологии выявленных Целевой локусов, создавая многочисленные пути кандидат, чтобы изучить. Мы демонстрируем здесь мультиплексированных генотипирования подход, позволяющий для расследования десятков до сотен SNPs с одной assay, подходит для человека когортные исследования4. Этот подход является относительно высокой через положили, позволяя сотни тысяч образцов ДНК быть генотипируемого для исследования Роман обнаружения и расследования конкретных путей. Методы, описанные здесь полезны для выявления риска аллелей и их ассоциации с клинических признаков сравнительно быстрой и экономичной основе. Эта платформа была весьма выгодным для скрининга и диагностических целей5,6и совсем недавно, для микробной инфекции7 и вирусом папилломы человека8.
Этот протокол начинается с выбора набора генов, для проведения расследования, т.е., целевых регионах, обычно определяется путем поиска литературы, или априори гипотезы для участия в процессе болезни; или возможно выбранных для репликации как ведущие ассоциации исследования генома всей ассоциации (GWA) обнаружения. Из набора генов исследователь будет выбрать изысканные список тегов ОНП. То есть взаимосвязь равновесия (LD), или корреляции, среди вариантов в регионе используется для идентификации представителя «тег SNP» для группы ОНП в высокой LD, известный как гаплотип. Высокая LD региона означает, что ОНП часто наследуются вместе таким образом, что генотипирование один SNP достаточна для представляют собой вариации на всех ОНП в гаплотип. Кроме того если после на окончательный список SNPs из многих регионов, например., репликация для изучения GWA, этот процесс может оказаться ненужным. Для мультиплексных генотипирования assay затем должны быть направлены вокруг этих целей, такие, что амплификации грунты различных массовых тем, расширение праймеров и продукцию производить интерпретируемых массовые спектров. Эти параметры легко осуществляются мультиплексированных генотипирования пробирного дизайн инструмента. Прямого и обратного праймеры от этой конструкции будет использоваться для целевых маркеры интерес и усилить последовательность, содержащую SNP. Расширение праймеры прикрепить непосредственно проксимальнее полиморфизмов и добавляется один, масса изменение, Терминатор база, которая дополняет SNP. База Терминатор предотвращает дальнейшее расширение ДНК. Масса модификация базы позволяет фрагменты, отличающихся единую базу, чтобы быть обнаружены с помощью масс-спектрометрии. Затем пластина, содержащие химии генотипирования применяется к чип для измерения на платформе масс-спектрометрии. После применения надлежащего контроля качества сырья генотипирования призывы, обнаруженных системой, данные можно экспортировать и использованы для статистического анализа для проверки для ассоциации с болезнью фенотипов.
Здесь мы демонстрируем метод мультиплексированных генотипирования с помощью масс-спектрометрии. Представитель результаты были получены с помощью ПЦР в паре с MALDI-TOF масс-спектрометрии4 с Пробирной химии, перечисленных в Таблица материалов13. С этой пл…
The authors have nothing to disclose.
Авторы имеют без подтверждений.
Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
Micropipettes | single and 8-channel | ||
Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
Plate rotator | |||
MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |