Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll, um die antimikrobielle Wirkung von 5-Aminolevulinic Säure-vermittelten die photodynamische Therapie (ALA-PDT) auf Staphylococcus Aureus Biofilm untersuchen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein in-Vitro Modell zur Untersuchung der Behandlung von bakteriellen Biofilmen mit PDT in der Zukunft zu entwickeln.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. Aureus) ist eine gemeinsame menschliche Erreger, wodurch pyogener und systemische Infektionen. S. Aureus Infektionen sind schwer, nicht nur durch die Entstehung von Antibiotika-resistenten Stämme, sondern auch seine Fähigkeit, Form Biofilme zu beseitigen. Vor kurzem hat die photodynamische Therapie (PDT) als eines der möglichen Behandlungen zur Steuerung von Biofilm-Infektionen angegeben wurde. Allerdings sind weitere Studien erforderlich, um unser Wissen über ihre Wirkung auf bakterielle Biofilme sowie die zugrunde liegenden Mechanismen zu verbessern. Dieses Manuskript beschreibt eine in Vitro -Modell der PDT mit 5-Aminolävulinsäure (5-ALA), ein Vorläufer der eigentlichen Photosensitizer Protoporphyrin IX (PpIX). Kurz, Reifen S. Aureus Biofilme mit ALA inkubiert und dann Licht ausgesetzt waren. Anschließend war die antibakterielle Wirkung der ALA-PDT auf S. Aureus Biofilm durch Berechnung der koloniebildenden Einheiten (KBE) quantifiziert und visualisiert durch Lebensfähigkeit fluoreszierende Färbung durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM). Repräsentative Ergebnisse zeigten eine starke antibakterielle Wirkung der ALA-PDT auf S. Aureus Biofilmen. Dieses Protokoll ist einfach und kann zur Entwicklung eines in-vitro- Modells um die Behandlung von S. Aureus Biofilme mit ALA-PDT zu studieren. In Zukunft könnte es auch in PDT Studien unter Verwendung anderer Photosensibilisatoren für verschiedene Bakterienstämme mit minimalen Anpassungen verwiesen werden.
Introduction
S. Aureus ist eine wichtige grampositive Erreger, die der Haut und der Schleimhaut des menschlichen Wirte kolonisiert. Seine Fähigkeit, Form Biofilme gilt als einen wichtigen Aspekt ihrer Pathogenese-1. Bakterielle Biofilme sind eine Gemeinschaft von Bakterien, die eingebettet in eine selbst erstellte Matrix, extrazelluläre Polymere Substanzen, einschließlich Polysaccharid, DNA und Proteinen besteht. Diese Matrix spielt eine bedeutende Rolle in der Persistenz von bakteriellen Infektionen, einen Beitrag zu einem hohen Grad des Widerstands gegen das menschliche Immunsystem und aktuellen antimikrobiellen Therapien2. Antibiotika sind noch die großen Behandlung für Biofilm-Infektionen, obwohl die Wirkung von Antibiotika auf Biofilme begrenzt sind. Bisher hat sich gezeigt, dass Zellen in Biofilmen 10 – 1.000 Mal resistenter gegen Antibiotika, die im Vergleich zu ihrer planktonischen Pendants3. Daher sind alternative Strategien erforderlich, um dieses Problem zu erobern.
PDT, eine alternative Behandlung für bakterielle Infektionen, nutzt das Licht einer geeigneten Wellenlänge Photosensibilisatoren aktivieren. Dies führt zu die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die tödlich für Ziel-Zellen sind durch die Zellwand stören, Inaktivierung von Enzymen und Beschädigung DNA4. Diese Multi-Target-Eigenschaft macht es schwierig für Bakterien Resistenz gegen die PDT-Behandlung entwickeln.
Die antimikrobielle Wirkung der PDT auf bakterielle und Pilzinfektionen Biofilme mit mehreren Photosensibilisatoren wie Toluidin blau, Malachitgrün, Methylenblau, Chlor e6 und Porphyrine, wurde in vorherigen Berichten5,6untersucht, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, zeichnet sich ein Prodrug von der tatsächlichen Photosensitizer PpIX, durch seine kleinen Molekulargewicht und schnelle Abfertigung12,14. Diese Vorteile geben ALA-PDT großes Potenzial als eine therapeutische Anwendung. Obwohl die Wirkung von ALA-PDT auf planktonischen Bakterien durch viele Gruppen12untersucht wurden, hat die antimikrobielle Wirkung der ALA-PDT auf bakterielle Biofilme noch nicht aufgeklärt. Unterdessen ist es schwierig, die Ergebnisse von früheren Studien zu vergleichen. Einer der Gründe ist, dass die verschiedenen Protokolle von verschiedenen Gruppen genutzt werden. Dieses Protokoll beschreibt also, eine in-vitro- Modell eines ALA-PDT-Systems basierend auf unserer bisherigen Arbeit15. Die Wirkung dieses Modells wurde von KBE Berechnung und Lebensfähigkeit Färbung mit CLSM bestätigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT wurde eine gut untersuchte Therapie für die Behandlung von Krebs, da es mehr als 100 Jahren erfunden wurde18. Im letzten Jahrzehnt PDT als antimikrobielle Strategie angewendet wurde und Wirksamkeit gegen einige Antibiotika-resistente Pathogene Bakterien12gezeigt hat. Im Vergleich zu den planktonischen Zustand, scheinen bakterielle Biofilme resistent gegen Antibiotika-Behandlung3, zu sein, während die Wirkung von ALA-PDT auf Biofilme noch nicht …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von National Nature Science Foundation of China für junge Wissenschaftler (Nr. 81300810), Shanghai junge Arzt Trainingsprogramm (Nr. 20141057) und National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 und 81571955) finanziert. Wir möchten LetPub (www.letpub.com) Danke für die sprachliche Unterstützung bei der Vorbereitung dieser Handschrift.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
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