Injections de lipopolysaccharides dans souris pour imiter l’entrée des produits d’origine microbienne après rupture de la barrière intestinale
Summary
Un protocole pour simuler l’entrée de composés d’origine bactérienne après rupture de la barrière intestinale est présenté ici. Une faible dose de lipopolysaccharide a été injectée systémique chez la souris, qui ont été observées pendant l’injection après 24 h. L’expression des cytokines pro-inflammatoires était déterminée à plusieurs moments dans la rate, du foie et du colon.
Abstract
La barrière épithéliale intestinale sépare l’hôte de la microflore est normalement tolérée ou ignorée. La violation de cette barrière se traduit par l’entrée de bactéries ou de produits dérivés de bactéries dans l’hôte, l’accès à la circulation de l’hôte et les organes internes menant à l’inflammation incontrôlée, comme observé chez les patients atteints de la maladie intestinale inflammatoire (MII), qui sont caractérisés par une augmentation de la perméabilité épithéliale intestinale.
Pour simuler l’entrée de composés d’origine bactérienne dans l’hôte, un modèle endotoxémie a été adoptée par les lipopolysaccharides (LPS), un composant de la paroi externe des bactéries Gram-négatives, ont été injectées à des souris. Dans cette étude, une dose de LPS a été injectée par voie intrapéritonéale et les souris ont été suivis par la suite pendant 8 h, à l’aide d’un score de maladie. En outre, l’expression taux de cytokines inflammatoires Il6, Il1b et Tnfa ont été analysés dans la rate, le foie et le colon de qPCR à des moments différents après injection de LPS. Ce modèle pourrait être utile pour les études portant sur l’étude des réponses immunitaires après l’invasion de micro-organismes ou de produits dérivés bactérien causés par un manquement de la barrière de la surface du corps.
Introduction
L’intestin humain est colonisé avec un grand consortium de micro-organismes qui forme le microbiote, qui a développé une relation mutuellement bénéfique avec l’hôte au cours de l’évolution. Dans cette relation, l’hôte fournit un créneau sûr pour la microflore, tandis que le microbiote fournit des vitamines, de la digestion des éléments nutritifs et de protection contre les agents pathogènes à l’hôte, où le microbiote réside1. Lorsque cette relation positive entre l’hôte et le microbiote est perturbée, les maladies peuvent se développer, tels que les maladies inflammatoires de l’intestin (MII). EIA est une maladie inflammatoire chronique multifactorielle de l’intestin causée par des facteurs génétiques et environnementaux qui se produisent sous deux formes principales, (CD) de la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse (Cu). Malgré les similitudes entre les deux formes de l’EIA, elles sont caractérisées par certaines différences dans la localisation et la nature des modifications inflammatoires. CD est une affection inflammatoire de rechute transmurale qui peut potentiellement s’étendre à n’importe quelle partie du tube digestif, tandis que l’UC est non transmural et est limité à du côlon. En outre, les mutations de liaison nucléotidique oligomérisation domaine protéine 2 (NOD2), un récepteur de reconnaissance de modèle (PRR) qui reconnaît MURAMYLE dipeptide (MDP), un composant de la paroi cellulaire des bactéries plus Gram positifs et – négatifs, est associé à CD2. En outre, Escherichia coli (e. coli), Listeria et streptocoques et leurs produits tous se trouvaient dans les macrophages chez les patients de CD qui sont entrés dans l’hôte après une barrière violent3. Lorsque les bactéries ou leurs produits dans l’hôte pendant l’élaboration du CD, le système immunitaire développe une réaction conduisant à la production d’anticorps anti-bacterial4en circulation. Peut-être, la preuve la plus convaincante pour le rôle de la microflore dans la pathogenèse de l’IBD provient de modèles murins. Lorsque les animaux est traités avec des antibiotiques, ou lorsque les souris sont maintenues dans des conditions sans germe (GF), la sévérité de la maladie est réduite dans la plupart des modèles de colite, comme dans IL 10-souris-/-qui ne se développent pas colitis en GF installations5,6. En outre, la colite perturbe également la composition de la microflore, qui se caractérise par une composition déséquilibrée et réduit la richesse appelé dysbiose7. La conséquence de l’IBD peut être une augmentation de la perméabilité intestinale pouvant mener à l’entrée de microbes et de produits d’origine microbienne dans l’hôte.
Chez les animaux, l’application de Dextran Sulfate de Sodium (DSS) a induit une atteinte épithéliale intestinale conduisant à une augmentation de la perméabilité de la barrière épithéliale8. Portail LPS concentrations sont élevées chez les animaux souffrant de colite DSS9. Fait intéressant, animaux manquant le C type lectine du récepteur spécifique adhérence intracellulaire molécule 3 saisissant nonintegrin liée au homologue 1 (signe-R1) sont protégés contre colite DSS et induite par LPS endotoxémie10. Pour diffuser dans l’hôte, les bactéries ou les bactéries provenant de produits doivent passer la barrière vasculaire11, la cavité péritonéale, où se trouve le petit et grand intestin, les ganglions lymphatiques mésentériques et/ou le foie12. Pour réduire la complexité de ce système, un composé dérivé de bactéries défini a été utilisé. LPS, ce qui provoque l’endotoxémie après voie intrapéritonéale ou par voie intraveineuse (i.v.) injection13 a été injectées à des souris, pour étudier l’expression de l’interleukines Il6 et Ilb et la cytokine Tnfa en réponse au LPS.
LPS est un motif moléculaire micro-organismes pathogènes associés (PAMP) exprimé en un composant de paroi cellulaire de bactéries à Gram négatif, consistant en lipide A (le PAMP principal dans la structure de LPS), un oligosaccharide de noyau et un O côté chaîne14. Récepteur de type Toll 4 (TLR4) exprimé par les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules épithéliales reconnaît LPS15, nécessitant des corécepteurs de liaison appropriée. La phase aiguë, la protéine liant le LPS (LBP) lie LPS pour former un complexe qui transfère le LPS au cluster de différenciation 14 (CD14), une protéine membranaire glycosylphosphatidylinositol-ancré. CD14 autres navettes LPS à l’antigène des lymphocytes 96 ou également connu sous le nom de MD-2, qui est associé avec le domaine extracellulaire de TLR4. La liaison du LPS à MD-2 facilite la dimérisation de TLR4/MD-2 pour induire des changements de conformation de recruter des molécules d’adapteur intracellulaire pour activer l’aval signalisation voie14, qui comprend la principale différenciation myéloïde gène de réponse 88 (MyD88) – voie dépendante et le TIR contenant du domaine adaptateur induisant l’interféron β (FTBC) – dépendant voie16. La reconnaissance du LPS par le TLR4 puis active la voie NF-κB et induit l’expression des cytokines pro-inflammatoires, telles que le TNFα, IL-6 et IL-1β17.
En particulier, lorsque le LPS est injecté dans des animaux, la concentration de LPS donné aux animaux, le bagage génétique de l’animal et le régime alimentaire doit être considérée. Des concentrations élevées de LPS conduit à un choc septique, caractérisée par une hypotension et des défaillances d’organes multiples et enfin à la mort de18. Souris sont moins sensibles aux LPS par rapport à l’homme, où les concentrations de LPS entre 2 à 4 ng/kg de poids corporel (PC) sont capables d’induire une tempête de cytokines19. Pour les souris, la dose létale (DL50), qui provoque la mort dans la moitié des gammes souris de 10 à 25 mg/kg de poids vif de20 selon la souche de souris utilisée. Pour les souches de souris couramment utilisés, C57Bl/6 et BALB/c, la dose létale 50 % (DL50) est de 10 mg/kg de poids vif. En revanche, les souches C3H/HeJ et C57BL/10ScCr sont protégés des LPS induits endotoxémie, qui est due à des mutations dans le Tlr421. En conséquence, les souris déficientes Tlr4 sont hyporéactivité à injections avec LPS22. Autres lignées de souris génétiquement modifiés, tels que les souris PARP1-/-23 sont résistantes au choc toxique induite par LPS.
Le modèle murin décrit ici utilise une dose de LPS administré systématiquement pour imiter les conséquences de la diffusion de LPS après une rupture de la barrière des surfaces du corps. La concentration choisie de LPS (2 mg/kg de poids vif) n’induit pas de mortalité chez des souris C56Bl/6, mais la libération induite par des cytokines pro-inflammatoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole imite des processus immunologiques qui se produisent après l’invasion de produits d’origine microbienne. Étapes critiques au sein du protocole sont la sélection de la lignée de souris, l’état d’hygiène des souris, la dose de LPS, la surveillance des animaux pour l’occurrence de l’endotoxémie et le point dans le temps de la fin de l’expérience. Plus important encore, le bagage génétique de la souche de souris doit être considérée. Souches de souris différents ont une sensibilité d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Patrick est pris en charge par la Fondation National Suisse (FNS 310030_146290).
Materials
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
Riferimenti
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
- Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn’s disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
- Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn’s patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
- Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
- Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).
- Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn’s disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
- Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
- Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
- Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
- Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
- Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).
- Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
- Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Cohen, J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 (2002).
- Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
- Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
- Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
- Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233 (2014).
- Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
- Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
- Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).
