Injecties van Lipopolysaccharide in muizen om na te bootsen ingang van microbiële afkomstige producten na de schending van de intestinale barrière
Summary
Hier wordt een protocol om na te bootsen de ingang van bacteriële afkomstige verbindingen na de schending van de intestinale barrière gepresenteerd. Een lage dosis subletale lipopolysaccharide werd systemisch geïnjecteerd in muizen, die werden gecontroleerd voor 24u na injectie. De expressie van pro-ontsteking cytokinen werd vastgesteld op verschillende tijdstippen in de milt, lever en dikke darm.
Abstract
De intestinale epitheliale barrière scheidt de host van de microbiota die normaal wordt getolereerd of genegeerd. De schending van deze barrière leidt tot de ingang van bacteriën of bacteriën afkomstige producten naar de host, toegang tot de host verkeer en binnenorganen leiden tot de ongecontroleerde ontsteking zoals waargenomen bij patiënten met een inflammatoire darmziekte (IBD), die worden gekenmerkt door een toegenomen permeabiliteit voor intestinale epitheliale.
Om na te bootsen de ingang van bacteriële afkomstige verbindingen in de gastheer, een endotoxemia model heeft vastgesteld in welke lipopolysaccharide (LPS), een onderdeel van de buitenste celwand van gram-negatieve bacteriën, waren geïnjecteerd in muizen. In deze studie een subletale dosis van LPS intraperitoneally werd geïnjecteerd en de muizen werden vervolgens gecontroleerd voor 8 h met gebruikmaking van een ziekte-score. Bovendien, de niveaus van de ontsteking cytokinen, Il6, Il1b, en Tnfa werden geanalyseerd in de milt, de lever en de dikke darm door de qPCR op verschillende tijdstippen expressie post LPS injectie. Dit model kan nuttig zijn voor de studies waarbij onderzoek van immuunresponsen na de invasie van micro-organismen of bacteriële afkomstige producten veroorzaakt door een breuk van de barrière van oppervlakken van het lichaam.
Introduction
De menselijke darm is gekoloniseerd met een groot consortium van micro-organismen die vormt de microbiota, die een wederzijds voordelige relatie met de host tijdens de evolutie heeft ontwikkeld. In deze relatie voorziet de host een veilige niche de microbiota, overwegende dat de microbiota levert vitaminen, nutriënten spijsvertering en bescherming tegen ziektekiemen naar de host, waar de microbiota1 verblijft. Wanneer deze heilzame relatie tussen de host en de microbiota wordt verstoord, kunnen ziekten ontwikkelen, zoals inflammatory bowel disease (IBD). IBD is een multifactoriële chronische ontstekingsziekte van de darm veroorzaakt door genetische en ecologische factoren die in twee belangrijke vormen, ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC optreden). Ondanks de gelijkenissen tussen de twee vormen van IBD, worden ze gekenmerkt door bepaalde verschillen in de locatie en de aard van de wijzigingen van de inflammatoire. CD is een recidiverende Transmurale inflammatoire aandoening die potentieel uit te tot elk deel van het maagdarmkanaal, breiden kan terwijl UC niet-Transmurale is en is beperkt tot de dikke darm. Bovendien, mutaties in Nucleotide-bindende oligomerisatie domein-bevattende eiwitten 2 (NOD2), een patroon erkenning receptor (PRR) die muramyl dipeptide (MDP), een onderdeel van de celwand van gram-positieve en meest – negatieve bacteriën herkent, is CD2is gekoppeld. Bovendien, Escherichia coli (E. coli), Listeria , streptokokken en hun producten alle bleken binnen macrofagen in CD-patiënten die de gastheer hebt ingevoerd nadat een barrière inbreuk op3. Wanneer bacteriën of naar hun producten de host tijdens de ontwikkeling van CD invoert, ontwikkelt het immuunsysteem een reactie die leidt tot de productie van circulerende antilichamen anti-bacteriële4. Misschien de meest overtuigende bewijs voor de rol van de microbiota in de pathogenese van IBD vloeit voort uit Muismodellen. Wanneer dieren worden behandeld met antibiotica, of wanneer de muizen zijn bewaard in kiem-gratis (GF) omstandigheden, is de ernst van de ziekte verlaagd in de meeste colitis modellen, zoals in de IL-10-/-muizen die geen colitis in GF voorzieningen5,6 ontwikkelen. Colitis verstoort bovendien ook de samenstelling van de microbiota, die wordt gekenmerkt door een onevenwichtige samenstelling en verminderd rijkdom genaamd dysbiosis7. Het gevolg van IBD kunnen een verhoogde intestinale permeabiliteit die tot de ingang van microben en microbiële afkomstige producten in de gastheer leiden kan.
In dieren induceert de toepassing van Dextran natriumsulfaat (DSS) een intestinale epitheliale inbreuk leidt tot een verhoogde doorlaatbaarheid van de epitheliale barrière-8. Portal LPS concentraties zijn verheven in dieren met DSS colitis9. Interessant is dat zijn dieren ontbreekt de C type lectine receptor specifieke intracellulaire adhesie molecuul-3 grijpen nonintegrin homolog-gerelateerde 1 (teken-R1) beschermd tegen DSS colitis en LPS-geïnduceerde endotoxemia10. Ter verdere verspreiding van de in de gastheer, moeten bacteriën of bacteriën afgeleide producten passeren de vasculaire barrière11, de peritoneale Holte, waarin de kleine en grote darm bevindt, de mesenterische lymfeklieren en/of de lever12. Verklein de complexiteit van dit systeem en werd een gedefinieerde bacteriële afkomstige omheind gebruikt. LPS, waardoor endotoxemia na intraperitoneale (i.p.) of intraveneuze (IV) injectie13 werd geïnjecteerd in muizen, de uitdrukking van de interleukins Il6 en Ilb en het cytokine Tnfa in reactie op LP’s te bestuderen.
LPS is een pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon (PAMP) uitgedrukt als een celwand onderdeel van gram-negatieve bacteriën, die uit een lipide-A bestaat (de belangrijkste PAMP in de structuur van LPS), een kern-oligosaccharide en een O kant keten14. Toll-like receptor 4 (TLR4) uitgedrukt door dendritische cellen, macrofagen en epitheliale cellen herkent LPS15, waarvoor co receptoren voor de juiste binding. De acute fase eiwit LPS-bindend-proteïne (LBP) bindt LPS vormen een complex dat de overdracht van LPS aan het cluster van differentiatie 14 (CD14), een glycosylphosphatidylinositol-verankerd membraan eiwit. CD14 verder shuttles LPS lymfocyt antigeen 96 of ook wel bekend als MD-2, die is gekoppeld aan de extracellulaire domein van TLR4. De binding van LPS naar MD-2 vergemakkelijkt de dimerisatie van TLR4/MD-2 voor het opwekken van conformationele wijzigingen in het werven van intracellulaire adapter moleculen om te activeren van de stroomafwaartse signalering traject14, waarin de primaire myeloïde differentiatie reactie gene 88 (MyD88) – afhankelijke traject en de TIR domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF) – afhankelijke traject16. De erkenning van LPS door TLR4 vervolgens activeert de NF-recombination pathway en induceert de uitdrukking van proinflammatoire cytokines, als TNFα, IL-6, IL-1β17.
In het bijzonder wanneer LPS wordt geïnjecteerd in de dieren, de concentratie van LPS gegeven om de dieren, moet de genetische achtergrond van het dier en het dieet worden beschouwd. Hoge concentraties van LPS leidt tot een septische shock, gekenmerkt door hypotensie en meerdere orgel stroomstoringen, en ten slotte aan dood18. Muizen zijn minder gevoelig voor LPS ten opzichte van mensen, waar LPS concentraties van 2-4 ng/kg lichaamsgewicht (BW) kunnen voor het opwekken van een cytokine storm19. Voor muizen, de letale dosis (LD50), die dood in de helft van de muizen varieert van 10-25 mg/kg BW20 afhankelijk van de gebruikte muis stam induceert. Voor de meest gebruikte muis stammen, C57Bl/6 en BALB/c, is de 50% van letale dosis (LD50) 10 mg/kg BW. In tegenstelling, worden de stammen C3H/HeJ en C57BL/10ScCr beschermd tegen LPS geïnduceerde endotoxemia, dat te wijten aan mutaties in Tlr421 is. Bijgevolg zijn Tlr4-deficiënte muizen hyporesponsive aan injecties met LPS22. Andere genetisch gemodificeerde muis lijnen, zoals PARP1-/-muizen23 resistent zijn tegen LPS-geïnduceerde toxische shock.
Het muismodel beschreven gebruikt hier een subletale dosis van LPS systemisch toegediend om na te bootsen de gevolgen van de verspreiding van de LPS na een schending van de barrière van het lichaam van de oppervlakken. De gekozen LPS concentratie (2 mg/kg BW) heeft geen veroorzaken sterfte in C56Bl/6 muizen, maar de geïnduceerde release van pro-inflammatoire cytokines.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol bootst immunologische processen die zich na de invasie door microbiële afkomstige producten voordoen. Kritische stappen in het protocol zijn de keuze van de lijn van de muis, de status van de hygiëne van de muizen, de dosis van LPS, de controle van de dieren ten behoeve van het voorkomen van endotoxemia, en het tijdstip van beëindiging van het experiment. Belangrijker nog, moet de genetische achtergrond van de muis stam worden beschouwd. Verschillende muis stammen hebben verschillende gevoeligheid voor LP…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN wordt ondersteund door de Zwitserse nationale Stichting (SNSF 310030_146290).
Materials
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
Riferimenti
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
- Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn’s disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
- Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn’s patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
- Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
- Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).
- Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn’s disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
- Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
- Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
- Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
- Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
- Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).
- Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
- Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Cohen, J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 (2002).
- Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
- Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
- Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
- Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233 (2014).
- Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
- Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
- Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).
