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GC-MS और MetaboliteDetector द्वारा Volatilome विश्लेषण के लिए ' Bornean विस्फोट चींटियों ' (Formicidae) से Mandibular ग्रंथि जलाशय सामग्री का अलगाव

Published: August 26, 2018 doi: 10.3791/57652
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4, 5, 5, 6, 7, 2, 1
1Center for Analytical Chemistry, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Life Sciences Vienna (BOKU), Austria, 2Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Vienna, Austria, 3Department of Computational Biology of Infection Research, Helmholtz Centre for Infection Research, Germany, 4Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, University of Technology (TU) Braunschweig, Germany, 52nd Zoological Department, Natural History Museum Vienna, Austria, 6Chemical Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei, 7Environmental and Life Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei

Summary

चींटी प्रजातियों Colobopsis explodens के माइनर श्रमिकों को मोम की तरह अलग करने के लिए उनके hypertrophied mandibular ग्रंथि जलाशयों में संग्रहीत बाद विलायक निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सामग्री के लिए विच्छेदित कर रहे हैं । एनोटेशन और अस्थिर घटक ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर MetaboliteDetector का उपयोग कर की पहचान भी वर्णित है ।

Abstract

इस पांडुलिपि का उद्देश्य Colobopsis cylindrica (COCY) समूह से संबंधित Bornean ' विस्फोट चींटियों ' के metabolomic विश्लेषण का वर्णन एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए है । इस प्रयोजन के लिए, मॉडल प्रजाति C. explodens का उपयोग किया जाता है। चींटियों नाबालिग कार्यकर्ता जाति से संबंधित विशिष्ट hypertrophied mandibular ग्रंथियों (MGs) के अधिकारी । प्रादेशिक युद्ध में, वे gastral झिल्ली (autothysis) के स्वैच्छिक टूटना द्वारा विशेषता आत्मघाती ' विस्फोट ' में प्रतिद्वंद्वी arthropods को मारने के लिए उनके बढ़े हुए mandibular ग्रंथि जलाशयों (MGRs) की चिपचिपा सामग्री का उपयोग करें । हम इस प्रजाति के कार्यकर्ता चींटियों का विच्छेदन मोम की gastral भाग के अलगाव के लिए की तरह प्रबंधक सामग्री दिखाने के रूप में अच्छी तरह के रूप में आवश्यक विलायक के लिए आवश्यक कदम लिस्टिंग-उसमें शामिल अस्थिर यौगिकों बाद गैस के साथ क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) विश्लेषण और चयापचयों की ख्यात पहचान निकालने में निहित. विच्छेदन प्रक्रिया कूल्ड शर्तों के तहत और किसी भी विच्छेदन बफर समाधान के उपयोग के बिना प्रबंधकीय सामग्री की रासायनिक संरचना में परिवर्तन को कम करने के लिए किया जाता है । अस्थिर चयापचयों के विलायक आधारित निष्कर्षण के बाद उसमें निहित, तरल इंजेक्शन-GC-MS के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक कदम प्रस्तुत कर रहे हैं । अन्त में, ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर MetaboliteDetector के उपयोग के साथ डाटा प्रोसेसिंग और ख्यात metabolite पहचान को दर्शाया गया है । इस दृष्टिकोण के साथ, profiling और चींटियों की MGRs में चयापचयों की पहचान-GC-MS और MetaboliteDetector सॉफ्टवेयर के माध्यम से COCY समूह से संबंधित संभव हो जाते हैं ।

Introduction

यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह का समग्र लक्ष्य कीटों के स्राव में रासायनिक रचनाओं की सामान्य जाँच है. यह एक पूरे, या उसके एकल यौगिकों के रूप में स्राव के पारिस्थितिक भूमिकाओं elucidating के प्राथमिक उद्देश्य के साथ किया जाता है । इसके अलावा, हम संबंधित स्राव में पाया यौगिकों अंतर्निहित चयापचय रास्ते की जांच करने में रुचि रखते हैं । चींटियों से विशेष रूप से ग्रंथि सामग्री (Hymenoptera, Formicidae) पिछले वर्षों में बढ़ती ब्याज प्राप्त की है, क्योंकि वे अब तक बेरोज़गार संभावित सक्रिय यौगिकों (गोंद, रोगाणुरोधी, आदि)1के सूत्रों प्रदान करते हैं, 2. COCY समूह3,4 से संबंधित कुछ प्रजातियों में से छोटे कार्यकर्ता चींटियों अपने hypertrophied MGRs जो mouthparts से गैस्ट्रोइसोफेजियल5,6से विस्तार में समाहित ऐसे यौगिकों प्रदान कर सकते हैं । जब ख्यात दुश्मनों ने धमकी दी, सी explodens7 और कुछ संबंधित प्रजातियों के छोटे श्रमिकों एक असामांय तरीके से अपने प्रबंधक सामग्री का उपयोग कर सकते हैं: वे अपने gastral दीवार rupturing द्वारा खुद को त्याग के चिपचिपा सामग्री बेदखल MGRs प्रतिद्वंद्वी पर विस्फोटक, whereupon ख्यात दुश्मन हिरासत में है और यहां तक कि5,6,8,9मर सकता है । विकास और इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों के उपयोग के उद्देश्य रासायनिक संरचना की समझ और इस चींटी स्राव के अंतरिम रूप से विषाक्त घटकों की प्रकृति में सुधार करने में मदद करने के लिए किया गया था ।

यह अंत करने के लिए, हम सी. explodens कार्यकर्ता चींटियों के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करने के बाद विलायक निष्कर्षण और जीसी-MS द्वारा विश्लेषण के साथ अपने मोम की तरह प्रबंधक सामग्री के gastral भाग प्राप्त करने के लिए ।

जीसी-एमएस विश्लेषण की रूपरेखा और वाष्पशील चयापचयों (volatilome) कीड़ों से पहचान के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीकों में से एक है । चींटियों में रुचि के ठेठ analytes cuticular हाइड्रोकार्बन10,11semiochemicals, और सामांय में, जैविक गतिविधि12के साथ यौगिकों शामिल हैं । नमूने पूरे जानवरों से या शरीर के अंगों और तरल पदार्थ से प्राप्त किया जा सकता है कीट13,14के विच्छेदन के माध्यम से पृथक । नमूना तैयारी तकनीकों में निहित चयापचयों के निष्कर्षण में शामिल सॉल्वैंट्स14 या headspace-ठोस-चरण-microextraction (HS-SPME)15के उपयोग के साथ ।

metabolomic अध्ययन के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों तेजी से सीधे नमूने के बाद जमे हुए हैं, ताकि रासायनिक संरचना और यौगिकों की मात्रा में परिवर्तन को कम करने के लिए । इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया चींटियों एक शांत गहरे जमे हुए ठंडे पैक के साथ भरवां बैग में साइट पर तेजी से ठंड से मारे गए थे । नमूने तो एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर जनरेटर चालित बिजली का उपयोग कर, इससे पहले कि वे सूखी बर्फ पर प्रयोगशाला में ले जाया गया में संग्रहीत किया गया । विच्छेदन प्रक्रिया यहां प्रस्तुत की संभावना पूरी चींटी या गैस्ट्रोइसोफेजियल एक पूरे के रूप में विश्लेषण के बिना प्रबंधक सामग्री को अलग करने के लिए प्रदान करता है, के रूप में यह अलग COCY प्रजातियों के लिए पहले किया गया है16,17,18। इसके अलावा, प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी, विष ग्रंथि (वी. पी.)5,8, Dufour ग्रंथि (डीजी)8, या आंतों अन्य जैविक अध्ययन, या करने के लिए की तरह आसपास के ग्रंथियों और ऊतकों के प्रत्यक्ष उपयोग और विश्लेषण सक्षम बनाता है संभव पार से हैंडलिंग या चींटियों के विच्छेदन के दौरान शुरू प्रदूषित के लिए जांच करें । विच्छेदन के दौरान प्रबंधक सामग्री की रासायनिक संरचना में परिवर्तन को कम करने के लिए, या तो गल नमूनों द्वारा या रसायनों का उपयोग करके, विच्छेदन प्रक्रिया किसी भी अतिरिक्त बफ़र्स के उपयोग के बिना, एक कोल्ड पैक (-20 डिग्री सेल्सियस) पर किया जा करने के लिए अनुकूलित किया गया था, धुलाई समाधान, या सॉल्वैंट्स । इस विधि के माध्यम से प्राप्त नमूनों गुणात्मक और मात्रात्मक प्रश्नों के उत्तर देने के लिए उपयुक्त हैं ।

ख्यात metabolite एनोटेशन और पहचान के प्रयोजन के लिए डेटा विश्लेषण ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर MetaboliteDetector19, जो जीसी-MS-आधारित metabolomics डेटा के स्वत: विश्लेषण के लिए विकसित किया गया था के माध्यम से किया जाता है । यह chromatograms में मौजूद एकल आयन चोटियों का पता लगाता है, एक deconvolution कदम करता है, और विश्लेषण नमूनों में निहित रासायनिक यौगिकों के deconvoluted मास स्पेक्ट्रा अर्क. MetaboliteDetector के साथ यौगिकों की ख्यात पहचान निर्धारित अवधारण सूचकांक पर आधारित है (आरआई; Kovats आरआई सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से गणना की जा सकती है) के रूप में अच्छी तरह से deconvoluted मास स्पेक्ट्रा की समानता । आरआई और वर्णक्रमीय मैच फैक्टर या तो मौजूदा संदर्भ पुस्तकालयों के खिलाफ पार की जांच की जा सकती है (है कि आयात किया जा सकता है, अगर वे आम NIST प्रारूप में हैं), या एक की स्थापना की घर में पुस्तकालय के खिलाफ । यह (ख्यात) यौगिक पहचान के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार सुझाव दिया है, जैसे, Metabolomics मानक पहल (MSI) के रासायनिक विश्लेषण कार्य समूह (CAWG) द्वारा, जहां दो स्वतंत्र और ओर्थोगोनल डेटा की एक न्यूनतम एक प्रामाणिक यौगिक के सापेक्ष (यहाँ प्रतिधारण समय (आरटी)/RI और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम) समान प्रयोगात्मक शर्तों के तहत विश्लेषण के लिए गैर उपंयास metabolite20पहचान की पुष्टि करने के लिए आवश्यक के रूप में प्रस्तावित कर रहे हैं ।

पूर्ण प्रयोग COCY मॉडल प्रजातियों सी explodensके प्रबंधकीय सामग्री पर आयोजित किया जाता है, लेकिन विच्छेदन कदम भी चींटी गैस्ट्रोइसोफेजियल में मौजूद अन्य ग्रंथियों को अलग करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं. इसके अलावा, जब हम प्रबंधकीय सामग्री के volatilome के व्यापक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, तो निष्कर्षण, GC-MS माप, और डेटा मूल्यांकन का वर्णन करने वाले कार्यप्रवाह के अधिक जेनेरिक भागों का विश्लेषण और (ख्यात) के लिए भी उपयोग किया जा सकता है सामान्य रूप से अस्थिर चयापचयों की पहचान ।

चूंकि इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोग कीटों पर किए जाते हैं, इसलिए कोई नैतिक अनुमोदन आवश्यक नहीं है । फील्ड काम, चींटियों के नमूने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रकाशन के लिए उनके उपयोग Universiti ब्रुनेई दारुसलाम, ब्रुनेई अनुसंधान और नवाचार केंद्र और ब्रुनेई के वानिकी विभाग, ब्रुनेई के माध्यम से इस परियोजना को विनियमित दिशा निर्देशों के अनुसार कर रहे है दारुसलाम.

Protocol

1. चींटियों का संग्रह

  1. एक aspirator (चित्रा 1) के उपयोग के साथ छोटे कार्यकर्ता चींटियों लीजिए ।
  2. नमूना लेने के तुरंत बाद,-20 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से ठंड से चींटियों को ठीक करने और विश्लेषण जब तक इस या एक कम तापमान पर उन्हें स्टोर ।

2. प्रबंधक सामग्री और चींटियों से डीजी का अलगाव

  1. चींटियों के विच्छेदन से पहले, निम्न तैयार करें:
    1. ग् पेट्री डिश और विच्छेदन यंत्रों को एक मेथनॉल-जल मिश्रण (MeOH/एच2ओ; 1 + 1 v/
      सावधानी: MeOH मनुष्यों के लिए विषाक्त है । हमेशा उपयुक्त दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, और काले चश्मे पहनते हैं, और एक धुएं हुड के तहत सफाई प्रदर्शन करते हैं ।
    2. फ्रीज, कोल्ड पैक और ग् पेट्री डिश को-20 ° c ।
    3. सिलिकॉन/polytetrafluoroethylene (PTFE) सेपता के साथ पेंच टोपियां सहित १.५ मिलीलीटर लघु धागा शीशियों के द्रव्यमान का निर्धारण और उंहें सीधे माइक्रोस्कोप के बगल में बर्फ पर रखो ।
      नोट: नमूना शीशी का विकल्प वैकल्पिक है । यहां, प्रबंधक सामग्री सीधे ठंडा १.५ मिलीलीटर कांच से बना शीशियों में डाल रहे हैं । प्लास्टिक यौगिकों शामिल कर सकते है (जैसे, phthalates) कि कलाकृतियों, जो लक्ष्य चयापचयों के संकेतों के साथ हस्तक्षेप का कारण हो सकता है ।
    4. एक बॉक्स में जमे हुए ठंड पैक जगह बाहर निकाला polystyrene फोम का बना । पेट्री डिश को कोल्ड पैक के ऊपर रखें और एक फ्रोजन चींटी को पकवान में डाल दें । एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत बॉक्स माउंट. आवर्धन समायोजित (20-40X) और ध्यान केंद्रित जब तक पूरी चींटी स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है ।
  2. अपनी gastral डिब्बों की अखंडता के लिए जमे हुए चींटी की जाँच करें । विच्छेदन के लिए, एक बरकरार गैस्ट्रोइसोफेजियल क्षेत्र के साथ केवल चींटियों ले (चित्रा 2a, बी) । आगे के विश्लेषण से चींटियों को उनके शरीर पर सपाट gasters या कठोर प्रबंधकीय सामग्री के निशान के साथ बाहर निकालें (चित्रा 2cडी) ।
  3. propodeum (पहला उदर खंड) में ठीक इत्तला दे दी संदंश की एक जोड़ी के साथ चयनित चींटी हड़पने के लिए और डंठल (दूसरा उदर खंड) में संदंश के अन्य जोड़ी के साथ । गैस्ट्रोइसोफेजियल क्षेत्र को अलग करके धीरे से इसे खींच कर चींटी के शरीर के बाकी भाग (3ए.) से दूर कर लीजिये ।
  4. ठीक के साथ धारण करके अब अलग चींटी गैस्ट्रोइसोफेजियल फिक्स-tergite 4 पर संदंश इत्तला दे दी । ठीक की एक और जोड़ी के साथ इत्तला दे दी संदंश tergite हड़पने 1 (डंठल के बगल में स्थित) और धीरे से इसे छीलने से दूर (चित्र 3 बी) । इस tergites 2 और 3 के लिए भी दोहराएं (चित्रा 3 सी, डी) MGRs के gastral भाग तक ( C. explodens कार्यकर्ता चींटियों में पीले रंग का है, लेकिन मिलीग्राम की सामग्री का रंग पीला से अधिक सफेद से लेकर अंय प्रजातियों में लाल कर सकते हैं) के लिए दिखाई दे रहा है सबसे भाग.
    नोट: exoskeleton को हटाकर, प्रबंधक की झिल्ली को भी आंशिक रूप से हटा दिया जाएगा ।
  5. एक विच्छेदन सुई का उपयोग करके, धीरे से उन्हें gastral डिब्बे (चित्रा 3E) के बाहर scratching द्वारा युग्मित MGRs के मोम की तरह सामग्री को दूर. केवल rupturing अंय ग्रंथियों चींटी गैस्ट्रोइसोफेजियल में मौजूद बिना अलग किया जा सकता है कि प्रबंधक सामग्री के उन भागों को हटा दें । यदि अधिक बल या प्रयासों को संपूर्ण के रूप में प्रबंधकीय सामग्री प्राप्त करने के लिए लागू किया जाना है, तो इसकी अपूर्णीय हटाने (आरेख 4) स्वीकार करें ।
  6. वे इस पर छड़ी जब तक धीरे उन्हें विच्छेदन सुई की नोक के साथ छू द्वारा प्रबंधक सामग्री उठाओ. फिर ज्ञात धड़ा द्रव्यमान के साथ एक ठंडा १.५ लघु धागा शीशी में प्रबंधक सामग्री स्थानांतरण ।
    1. विच्छेदन सुई की नोक से चिपचिपा प्रबंधक सामग्री को हटाने के लिए, नमूना शीशी की दीवार के लिए सुई टिप ले जाने और उन्हें दीवार पर धब्बा. शीशी बंद करो और यह बर्फ पर जगह जब तक अगले प्रबंधक सामग्री अलग कर रहे हैं ।
  7. बाद में आसंन महानिदेशक (धारा 6) से उत्पन्न यौगिकों द्वारा प्रबंधक सामग्री नमूना के संभावित पार संदूषण के लिए जाँच करने के लिए, भी चींटियों से DGs इकट्ठा, जिसमें वे अभी भी बरकरार हैं (चित्रा 4) और उन्हें एक अलग HPLC शीशी में डाल दिया.
  8. MeOH/एच2ओ (1 + 1 v/v), जब ग्रंथि से ग्रंथि या चींटी से बदलने के साथ पेट्री पकवान और विच्छेदन उपकरणों को हमेशा साफ ।
  9. एक विश्लेषणात्मक नमूना के लिए, जलाशय सामग्री या एकाधिक चींटियों की ग्रंथियों गठबंधन ।
    नोट: ग्रंथियों या उनकी सामग्री एक विश्लेषणात्मक नमूना के लिए उपयोग की संख्या प्रयोग डिजाइन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । यहां, या तो प्रबंधक सामग्री या पांच चींटियों के DGs एक विश्लेषणात्मक नमूना प्राप्त करने के लिए परित थे ।

3. विलायक-पृथक ग्रंथि सामग्री का निष्कर्षण

  1. विश्लेषणात्मक नमूनों की जनता का निर्धारण (यहां, प्रबंधक सामग्री या आसंन ग्रंथियों पांच चींटियों से परित) ।
  2. बर्फ जोड़ें-शीत उच्च शुद्धता एथिल एसीटेट (EtOAc) के एक निरंतर अनुपात में 1:14 w/v और भंवर के लिए नमूनों 5 मिनट के तहत ठंडा शर्तों; यहां, एक थर्मोस्टेट प्रयोगशाला में 7 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया ।
  3. 7 डिग्री सेल्सियस पर ३,८२० x g पर 10 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक और supernatants स्थानांतरण (के बारे में 55-75 µ एल प्रबंधक सामग्री पांच चींटियों से प्राप्त निकालने के लिए) पूर्व में ठंडा १.५ एमएल लघु धागा शीशियों युक्त ०.१ एमएल माइक्रो आवेषण । कस छेद और लाल रबर युक्त पेंच टोपी के साथ शीशियों सील/PTFE सेपता ।
    नोट: विश्लेषण किया जा सकता है, तो तुरंत, निकालने पर-८० ° c विश्लेषण तक रखें, लेकिन यह नमूनों का विश्लेषण करने के लिए तुरंत तैयार करने के बाद की सिफारिश की है ठंड के दौरान रासायनिक परिवर्तन के जोखिम को कम करने के लिए/गल चक्र ।

4. जीसी-एमएस

  1. एक पूर्ण GC-MS माप अनुक्रम के लिए, निम्न समाधान तैयार करें, प्रत्येक में एक १.५ मिलीलीटर लघु धागा शीशी:
    1. hexane का उपयोग कर यौगिक प्रति 8 मिलीग्राम/एल के अंतिम एकाग्रता के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध alkane मानक समाधान कमजोर द्वारा एक आरआई calibrant मिश्रण तैयार करें ।
    2. शुद्ध EtOAc से मिलकर एक विलायक-रिक्त तैयार करें ।
  2. 1) विलायक-रिक्त, 2) आरआई calibrant मिश्रण, 3) प्रबंधक सामग्री निकालने, और 4) डीजी सामग्री निकालने की शीशियों को ठंडा ट्रे (10 डिग्री सेल्सियस) में गैस chromatograph (GC) के लिए युग्मित की है ।
    नोट: यह समय अवधि प्रत्येक शीशी माप करने से पहले नमूना में रखा जाता है को कम करने के लिए सिफारिश की है. महत्वपूर्ण नमूनों के लिए, प्रबंधकीय सामग्री नमूना की तरह, शीशियों विश्लेषण से पहले तुरंत नमूना में रखा जा सकता है.
  3. प्रत्येक नमूने के लिए, एक 1 µ l aliquot में GC-MS क्रोमेटोग्राफिक जुदाई के लिए एक कॉलम पर लक्ष्य यौगिकों के लिए उपयुक्त इंजेक्षन (यहाँ: HP-5MS UI स्तंभ).
    1. उपयुक्त GC पैरामीटर, जो निम्नानुसार दिख सकता है सेट करें:
      1. वाहक गैस के रूप में हीलियम का उपयोग करें और एक स्थिर कॉलम प्रवाह सेट 1 मिलीलीटर/2 मिनट के लिए एक पकड़ के साथ ४० डिग्री सेल्सियस से शुरू एक ओवन तापमान रैंप सेट, 7 मिनट की एक पकड़ समय के साथ 10 डिग्री सेल्सियस/मिनट के लिए ३३० डिग्री सेल्सियस के एक रैंप के द्वारा पीछा किया । प्रवेश तापमान सेट करने के लिए २७० ° सी.
      2. चुनें, और यदि आवश्यक हो, पर्याप्त चोटी आकार और ब्याज के यौगिकों के लिए तीव्रता में परिणाम है कि जीसी-एमएस इंजेक्शन के लिए विभाजित अनुपात समायोजित (चित्रा 5) ।
        नोट: प्रस्तुत उदाहरण में यह 2:1 के एक विभाजन के अनुपात में डीजी निकालने को मापने के लिए आवश्यक था और आरआई calibrant मिश्रण विभाजित मोड में । प्रबंधक सामग्री निकालने 2:1 और 50:1 पर एक दूसरी बार के विभाजन के अनुपात में विश्लेषण किया गया था ।
      3. ३५० डिग्री सेल्सियस के लिए सहायक तापमान निर्धारित करें ।
    2. मास-स्पेक्ट्रोमीटर (ms) के पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: एमएस स्रोत तापमान २३० ° c, एमएस Quad तापमान १५० ° c, स्कैन रेंज से कम द्रव्यमान 30 करने के लिए उच्च जन ५००, विलायक देरी ४.१ मिनट (विलायक रिक्त और प्रयोगात्मक नमूनों के लिए) या ६.१ मिनट (आरआई calibrant मिश्रण के लिए) क्रमशः. स्कैन दर लगभग 3 स्कैन करने के लिए सेट करें/
      नोट: एमएस पैरामीटर, विशेष रूप से एमएस स्कैन-, नमूना दर, और चक्र समय पीक उठा और स्पेक्ट्रम deconvolution को प्रभावित कर सकते हैं और MetaboliteDetector सॉफ्टवेयर के साथ उचित डेटा मूल्यांकन के लिए पैरामीटर सेटिंग्स का चयन करते समय विचार किया जाना चाहिए.
  4. माप के पूरा होने पर, डेटा के रूप में निर्यात करें । आइआ परियोजना फ़ाइल (GC के साथ दिया डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ यहाँ प्रदर्शन किया) एक पोर्टेबल डेटा भंडारण डिवाइस पर.
    1. फ़ाइल का चयन करें । डेटा निर्यात आइआ प्रारूप करने के लिए..., फिर जांच नई निर्देशिका बनाएं और ठीकक्लिक करें । वांछित भंडारण स्थान का चयन करें (जैसे, USB फ्लैश ड्राइव) और क्लिक करें खुला। निर्यात और ---> चिह्न हिट करने के लिए फ़ाइलों का चयन करें । क्लिक प्रक्रियाके साथ की पुष्टि करें ।

5. Metabolite का पता लगाने और MetaboliteDetector सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ पहचान

  1. डेटा फ़ाइलों का विश्लेषण शुरू करने से पहले, MetaboliteDetector खोलें, उपकरण चुनें । सेटिंग्स, और इस प्रकार के रूप में आवश्यक पैरामीटर सेट (MetaboliteDetector के व्यक्तिगत चादरें बोल्ड में संकेत कर रहे हैं):
    1. पत्रक प्रकटनमें, समय स्केल को ंयूनतम पर सेट करें और अक्ष लेबल्स विकल्प को सक्षम करें ।
    2. पत्रक Deconvolutionमें, करने के लिए सर्वोच्च सेटिंग्स के लिए पैरामीटर सेट करें: पीक थ्रेशोल्ड: 10, और न्यूनतम पीक ऊँचाई (शोर इकाइयों): 10. आधारभूत समायोजन को सक्षम करना अनचेक करें । Metabolite डिटेक्शन के लिए पैरामीटर्स सेट करें: डिब्बे/स्कैन: 10, Deconvolution चौड़ाई (स्कैन): 5, आवश्यक तीव्रता (बेस पीक का%): 0, और आवश्यक चोटियों की संख्या: 10 ।
    3. पत्रक पहचानमें, लायब्रेरी खोज विकल्प सेट करने के लिए: यौगिक Lib: ' CalibrationLibrary_Alkanes ' और NIST (एक NIST sqlite पुस्तकालय. lbr प्रारूप में शामिल किया जा सकता है) । निम्नानुसार पैरामीटर सेट करें: Max. आरआई अंतर: 10, कटऑफ स्कोर: ०.९, शुद्ध/पतित रचना: ०.५, अंशों की संख्या: 2, समान frag की ंयूनतम संख्या.: 1. का प्रयोग करें स्केल्ड lib: ticked; समानता स्कोर: कल्पना. समानता; मास फ़िल्टर: m/z २०७, २२१, २८१, ३५५, और ११४७ (ज्ञात दूषित GC-स्तंभ के स्थिर चरण से उत्पंन होने के लिए) ।
    4. पत्रक में ठहराव सेट करने के लिए पैरामीटर: ठहराव आयनों की संख्या: 3, बाद आयनों के बीच न्यूनतम दूरी: 5, और न्यूनतम आवश्यक गुणवत्ता सूचकांक: 1. ठहराव आयनों २०७, २२१, २८१, ३५५, और ११४७ बाहर निकालें ।
      नोट: उच्च रिज़ॉल्यूशन MS डेटा के मामले में, इसके अतिरिक्त निंन पैरामीटर को पत्रक केन्द्रक में सेट करें: पीक थ्रेशोल्ड शुरू: 10, पीक थ्रेशोल्ड अंत:-5, और अधिक से अधिक आधारभूत दूरी: 30, FWHM: ०.५ ।
  2. में फ़ाइलों को आयात करें । CDF स्वरूप जनरेट किया गया में निहित है । आइआ प्रोजेक्ट फ़ाइल के रूप में । फाइल का चयन करके MetaboliteDetector सॉफ्टवेयर में NetCDF | आयात । NetCDF आयात। फ़ोल्डर के आकार का चिह्न चुनें, और तब आयात और संसाधित किया जा करने के लिए नमूना श्रेणियों के लिए फ़ाइलों का चयन करें: 1) विलायक रिक्त, 2) आरआई calibrants, 3) प्रबंधक सामग्री निकालने, और 4) डीजी सामग्री निकालने । डेटा संसाधन प्रारंभ करने के लिए ठीक के साथ की पुष्टि करें । संसाधन के बाद, प्रकट होने वाली विंडो में बंद करेंका चयन करें ।
  3. आरआई अंशांकन और प्रबंधकीय निकालने में निहित यौगिकों के लिए आरआई मूल्यों के निर्धारण के लिए, फ़ाइल का चयन करें । खोलें और आरआई calibrants के डेटा युक्त फ़ाइल चुनें ।
    1. आरआई calibrant फ़ाइल खोलने के बाद, आवर्धक कांच आइकन का चयन करें । ठीकसे दिखने वाली विंडो की पुष्टि करें ।
    2. उचित आरआई अंशांकन के लिए, आरआई calibrant फ़ाइल में जासूसी alkanes की श्रेणी की जांच करें ।
      1. यह अंत करने के लिए, पहले चोटी की अधिकतम के नीचे प्रदर्शित होने त्रिकोण का चयन करें, पहले alkane से (सबसे कम आरटी, 6 चित्राके साथ) एक बार उस पर क्लिक करके detectable से उद्भव ।
      2. उच्चतम स्पेक्ट्रम समानता (' कल्पना. sim. ' के साथ हिट की जाँच करें, अधिकतम स्कोर = 1) alkane पुस्तकालय प्रविष्टियों की तुलना में (चित्रा 6).
      3. सुझाए गए alkane यौगिक की पहचान को सत्यापित करने के लिए, साहित्य में दी गई जन स्पेक्ट्रम के लिए अपने बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम की तुलना करें, जैसे, NIST रसायन विज्ञान22WebBook.
      4. वर्णलेख में प्रकट होने वाले अंतिम alkane शिखर को गिनते हुए ्ि calibrant मिश्रण में अंतिम alkane डिटेक्टिव निर्धारित करें ।
    3. आरआई अंशांकन के लिए, का चयन करें उपकरण । री-अंशांकन विज़ार्ड। अगलाका चयन करें ।
    4. फ़ोल्डर के आकार का चिह्न पर क्लिक करें और आरआई calibrant मिश्रण के वर्णलेख युक्त फ़ाइल का चयन करें । अगलाका चयन करें ।
    5. प्रकट विंडो में alkane calibrants के लिए प्रविष्टियों वाली लायब्रेरी का चयन करें ।
    6. आरआई calibrant फ़ाइल में सभी alkanes detectable की लाइब्रेरी प्रविष्टियों का चयन करें और > > आइकन क्लिक । > >का चयन करने के बाद, अगलाचुनें ।
    7. प्रत्येक खोज alkane के लिए सूचीबद्ध RTs में दिखने वाली तालिका की जाँच करें । इस अंत करने के लिए, संबंधित त्रिभुज (चित्रा 7) पर क्लिक करके प्रत्येक alkane के लिए मुख्य विंडो में चित्रित RTs की जांच करें । यदि आवश्यक (चित्रा 8), नीचे अंशांकन तालिका में आरटी को ठीक से संबंधित क्षेत्र में डबल क्लिक करके, ड्रॉप डाउन मेनू का चयन, और सही सुझाव आरटी चुनने । वैकल्पिक रूप से, कुंजीपटल की मदद से rt में लिखें ( चित्र 9) ।
    8. जब प्रत्येक alkane के लिए RT सही है, तो अगलाचुनें. क्लिक करें, Next दिखाई दे रहे विंडो में री अंशांकन तालिका दिखा रहा है ।
    9. का चयन करें हरे + प्रतीक interview वर्णलेख चयन विंडो में, विलायक-रिक्त और ग्रंथि निष्कर्षों की फ़ाइलों की डेटा फ़ाइल का चयन करें, और अगलाका चयन करें । पैरामीटर सेटिंग्स को interview विंडो में निम्नानुसार सेट करें: आधारभूत समायोजन का अक्षम करना, पीक थ्रेशोल्ड: 5, न्यूनतम पीक ऊँचाई: 5, डिब्बे/स्कैन: 10, और Deconvolution चौड़ाई: 5. हिट अगला और फिर आरआई गणना प्रदर्शन करने के लिए शुरू चयनित नमूना फ़ाइलों में शामिल यौगिकों ।
  4. एनोटेशन और प्रबंधक निकालने में चुना चयापचयों की पहचान के लिए, मापा प्रबंधक सामग्री निकालने के डेटा फ़ाइल खोलें, जिसके लिए RIs ऊपर वर्णित के रूप में गणना की गई है (step 5.3.9), फ़ाइल का चयन करके । खोलना और वांछित डेटा फ़ाइल को चुनना ।
    1. उपकरण का चयन करें । सेटिंग्स । Deconvolution और पीक थ्रेशोल्ड के साथ ही न्यूनतम पीक ऊँचाई (शोर इकाइयों) दोनों को 5 में परिवर्तित करें. आवर्धक कांच आइकन का चयन करें और ठीकसे दिखने चेतावनी खिड़की फिर से पुष्टि ।
    2. एक त्रिकोण पर क्लिक करें ब्याज की एक चोटी की अधिकतम नीचे प्रदर्शित होने और NIST में संग्रहीत लोगों के साथ अपने बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम की तुलना NIST आइकन का चयन करके पुस्तकालय ।
    3. NIST-खोज के पहले परिणामी हिट का चयन करें (चित्र 10) ।
    4. यदि ब्याज के यौगिक के परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रम समानता चुना स्पेक्ट्रम समानता स्कोर (यहां ≥ ०.९) एक NIST प्रवेश (चित्रा 10) की तुलना में ऊपर है, आरआई देखो (GC कॉलम, फिल्म मोटाई, और कॉलम के समान स्थिर चरण के लिए व्यास) साहित्य में इस यौगिक के लिए दिया (उदा., NIST केमिस्ट्री WebBook२२).
    5. NIST संदर्भ आरआई के बीच सापेक्ष अंतर की गणना (या एकाधिक आरआई मूल्यों दिया जाता है जब औसत RIs) और प्रयोगात्मक प्राप्त आरआई. यदि अंतर बराबर या कम उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट अधिकतम सहन मूल्य से है (यहां, ≤ ± 1%), के रूप में यौगिक नामित ' व्याख्या ' ।
    6. दोहराएं चरण 5.4.2 – 5.4.5 प्रबंधकीय नमूना फ़ाइल में शामिल ब्याज की सभी यौगिकों के लिए ।
    7. यौगिक पहचान के लिए, आरआई और जन स्पेक्ट्रा मानक समाधानों की तुलना करें (जैसे, 2-100 mg/L) एक ही स्थिति के तहत मापा के रूप में व्याख्या यौगिकों के उन लोगों के लिए खंड 4 में वर्णित.
    8. मानक के रूप में खंड 4 में समझाया गया विश्लेषण और परिणामी डेटा चरण ४.४ और ५.२ में alkane-और प्रबंधकीय सामग्री ग्रंथि डेटा के लिए वर्णित के रूप में संसाधित करें ।
    9. उपकरण का चयन करके मानक से प्राप्त डेटा जांचना । री-अंशांकन जादूगर । अगले और एक ही आरआई calibrant फ़ाइल के रूप में पहले इस्तेमाल का चयन । अगलाका चयन करें, और फिर अगले और हरे + प्रतीक पर क्लिक करके मानक समाधान से प्राप्त डेटा युक्त फ़ाइल का चयन करें । अगले मारो और फिर मानक यौगिक के लिए आरआई की गणना शुरू करते हैं ।
      नोट: यदि मानक के विश्लेषण नमूना विश्लेषण के बाद तुरंत नहीं किया जा सकता है, यह आरआई calibrants फिर से विश्लेषण और नए आरआई अंशांकन और मानक के लिए गणना करने के लिए सिफारिश की है ।
    10. मानक के लिए संबंधित फ़ाइल खोलें और चरण 5.4.2 में बताया गया के रूप में NIST-पुस्तकालय के साथ अपने स्पेक्ट्रम की तुलना द्वारा अपनी पहचान की पुष्टि करें ।
    11. मानक की पहचान की पुष्टि करने के बाद, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम और मानक यौगिक के आरआई में घर पुस्तकालय जोड़ें । इस अंत करने के लिए, हरे + प्रतीक पर क्लिक करें और पुस्तकालय प्रविष्टि का पसंदीदा नाम दर्ज । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम और पुस्तकालय के लिए मानक यौगिक के आरआई जोड़ने के लिए ठीक के साथ की पुष्टि करें । यदि लायब्रेरी में नई प्रविष्टि नहीं देखी जा सकती, तो ताज़ा करें बटन को सक्रिय ।
      नोट: यदि आरआई अंशांकन सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया था, MetaboliteDetector द्वारा निर्धारित आरआई संबंधित पुस्तकालय-प्रवेश में दिखाई देगा । मानक के लिए पुस्तकालय प्रविष्टि बनाने के बाद, आरआई और स्पेक्ट्रा समानता का एक संयोजन के आधार पर एमजी निकालने में इस metabolite की पहचान संभव है.
    12. प्रबंधकीय सामग्री डेटा फ़ाइल फिर से खोलें । उपकरण का चयन करें । सेटिंग्स । शिनाख्तकी । अब, मानक यौगिक के आरआई के रूप में गणना की है और पुस्तकालय प्रविष्टि में जोड़ा, संयुक्त स्कोरकरने के लिए स्पेक्ट्रम समानता से समानता स्कोर बदल जाते हैं ।
    13. आवर्धक कांच आइकन पर क्लिक करें और यौगिक है कि कदम 5.4.5 में व्याख्या की गई है नीचे त्रिकोण का चयन.
    14. हिट पर क्लिक करें और ' समग्र समानता स्कोर ' के लिए दिए गए मूल्य की जांच (OSS, ' समग्र simil. ' के रूप में Metabolite डिटेक्टर द्वारा संक्षिप्त), स्पेक्ट्रम समानता और आरआई समानता स्कोर (11अंक) का एक संयोजन पर विचार ।
      नोट: यदि एक हिट में घर के पुस्तकालय में पाया गया था, यह मुख्य विंडो के दाईं ओर पर प्रदर्शित किया जाएगा.
    15. यदि OSS उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित सीमा से ऊपर है (यहां ≥ ०.९, भी त्रिकोण के हरे रंग के द्वारा संकेत), यौगिक के रूप में नामित ' पहचान ' (चित्रा 11) ।

6. महानिदेशक सामग्री द्वारा संदूषणों के लिए प्रबंधकीय सामग्री निकालने की जांच

  1. उस डीजी नमूने की नपे फाइल को खोलें जिसके लिए MetaboliteDetector (step 5.3.9) के साथ RIs के यौगिकों की गणना पहले ही की जा चुकी है ।
  2. मिलीग्राम सामग्री नमूना और डीजी नमूना की माप के बाद प्राप्त वर्णलेख के एक ओवरले के लिए, का चयन करें उपकरण । वर्णलेख ओवरले और हरी + आइकन के माध्यम से दो संबंधित फ़ाइलों का चयन करें । ठीकसे पुष्टि करें ।
  3. ओवरले देखने के लिए, विंडो के निचले भाग पर interview वर्णलेख ओवरले शीट का चयन करें.
  4. प्रबंधक सामग्री निकालने (चित्रा 12) और डीजी सामग्री निकालने के बीच यौगिकों के ओवरलैप के लिए जाँच करें और आगे प्रबंधकीय सामग्री विश्लेषण से अतिव्यापी यौगिकों को बाहर निकालें ।

Representative Results

एक योजनाबद्ध कार्यप्रवाह C. explodens के ग्रंथि स्राव में ख्यात metabolite पहचान करने के लिए प्रयोगात्मक चरणों लिस्टिंग चित्रा 13में दिखाया गया है । इसके अलावा, प्रस्तुत प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया COCY कार्यकर्ता चींटियों के सबसे महत्वपूर्ण शरीर के अंगों के एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन अनुपूरक आंकड़ा एस एक, बीके रूप में प्रदान की जाती है । प्रमुख कदम चींटियों के विच्छेदन से जब तक ख्यात metabolite की पहचान में प्रबंधकीय सामग्री के पूरक आंकड़ा S2में सचित्र हैं ।

volatilome विश्लेषण के लिए उपयुक्त प्रबंधक सामग्री को अलग करने के लिए, एक शांत राज्य परिवहन, भंडारण, और भी विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान भर में बनाए रखा गया था । यह अंत करने के लिए, चींटियों तुरंत एक कीट aspirator के उपयोग के साथ उनके संग्रह के बाद जमे हुए थे (खंड 1 और आंकड़ा 1) सीटू में। एक-20 ° c फ्रीजर में 2 दिनों के लिए भंडारण के बाद, चींटी के नमूनों ऑस्ट्रिया, जहां वे तुरंत आगे विश्लेषण तक-८० डिग्री सेल्सियस पर डाल दिया गया सूखी बर्फ पर ले जाया गया । अपने प्रबंधकीय सामग्री के अलगाव के लिए चुने जाने के लिए उपयुक्त चींटियां एक गैस्ट्रोइसोफेजियल क्षेत्र जो दौर और अक्षुण्ण (चित्रा 2a) और सबसे अच्छा मामले में प्रबंधकीय सामग्री के साथ अच्छी तरह से रखता है, जैसा कि tergites (चित्रा बी) के बीच दिखाई देने वाले प्रबंधक द्वारा दर्शाया गया है । चींटियों की Gasters जो आगे के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं चित्रा 2cमें दिखाया गया हैडी। मुख्य कदम (कदम 2.3-2.6) COCY चींटियों से प्रबंधकीय सामग्री के अलगाव की प्रक्रिया में शामिल चित्रा 3में सचित्र हैं । पृथक प्रबंधकीय सामग्री ( C. explodensके मामले में पीला, लेकिन रंग सफेद से COCY समूह से संबंधित अन्य प्रजातियों में लाल करने के लिए रेंज कर सकते हैं) चित्रा 14में दिखाया गया है.

जब उनके प्रबंधकीय सामग्री के लिए चींटियों विदारक, ध्यान पंचर या किसी भी अंय ग्रंथियों या आंतों (चरण २.५) टूटना नहीं लिया जाना चाहिए । चित्रा 4 एक विच्छेदित चींटी गैस्ट्रोइसोफेजियल है कि अभी भी दो अंय, बरकरार ग्रंथियों (डीजी और वी. पी.) शामिल है दिखाता है प्रबंधकीय सामग्री के अलगाव के बाद । चींटी आंतों की सामग्री द्वारा दिखाई संदूषण का एक उदाहरण चित्रा 15में दिखाया गया है । महानिदेशक सामग्री के साथ क्रॉस-संदूषण के बाद से, प्रबंधक के नीचे स्थित, पूरी तरह से टाला नहीं जा सकता, प्रोटोकॉल का एक हिस्सा प्रबंधकीय सामग्री निकालने (धारा 6) से संकेतों के साथ परिणामी संकेतों की तुलना के लिए इन ग्रंथियों का विश्लेषण करने के लिए दर्शाया गया है । जब विच्छेदन प्रक्रिया ठीक से किया जाता है, यह लगभग 0.75-1.2 प्रति चींटी सामग्री की मिलीग्राम प्राप्त करने के लिए संभव है । प्रोटोकॉल के लिए यहां वर्णित, पांच चींटियों के प्रबंधक सामग्री को 3.9-5.9 मिलीग्राम प्रत्येक के दोहराव नमूने प्राप्त करने के लिए परित थे ।

पृथक ग्रंथि जलाशय सामग्री EtOAc (धारा 3) के साथ निकाले गए और जीसी-MS (धारा 4) द्वारा विश्लेषण किया गया । explodens कार्यकर्ता चींटियों की मिलीग्राम सामग्री निकालने की माप एक वर्णलेख में चोटियों और ख्यात प्रबंधकीय सामग्री यौगिकों के दर्जनों (चित्रा 5) के लिए मास स्पेक्ट्रा के शामिल परिणाम. दो प्रमुख चयापचयों 1-(2, 4, 6-trihydroxyphenyl)-ethanone (id 4) और 5, 7-dihydroxy-2-methylchromen-4-एक (आईडी 5) में मिलीग्राम सामग्री निकालने के कारण स्तंभ ओवरलोडिंग, यही कारण है कि एक ही नमूना फिर से विश्लेषण किया गया था एक उच्च विभाजन अनुपात में 50:1 ( चित्रा 5, इनसेट) । संभव क्रॉस-संदूषण के घटक द्वारा प्रबंधकीय सामग्री के महानिदेशक उदाहरण के लिए, GC-MS वर्णलेख देर RTs प्रदर्शन में अतिरिक्त चोटियों के रूप में दिखाई जाएगी, के बारे में मिनट से शुरू 29 (12 अंक) । क्रोमेटोग्राफिक चोटियों और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा के यौगिकों को छोड़कर भी विलायक-रिक्त में पाया, GC कॉलम के स्थिर चरण से उद्भव, या गैस्ट्रोइसोफेजियल चींटी में मौजूद डीजी की सामग्री से, और MetaboliteDetector के साथ बाद में प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर शोर अनुपात ≥ 10 के लिए एक संकेत के साथ के बारे में ११० प्रबंधक सामग्री यौगिकों के परिणामस्वरूप । बाद में metabolite एनोटेशन और MetaboliteDetector सॉफ्टवेयर के साथ पहचान के लिए, chromatograms पर तुले हुए थे और आरआई मूल्यों मापा नमूना फ़ाइलों के लिए निर्धारित किया गया (चरण ५.३ और उप कदम, चित्रा 6, चित्रा 7 , चित्र 8 , चित्र 9) । पता ख्यात प्रबंधक सामग्री चयापचयों स्पेक्ट्रम समानता का NIST-पुस्तकालय है, जो प्रस्तुत उदाहरण में MetaboliteDetector सॉफ्टवेयर का एक अभिंन अंग का गठन करने के लिए एक संयोजन के आधार पर व्याख्या कर रहे थे (चरण ५.४ और उप कदम, 10 चित्रा ). इसके अलावा, आरआई एक ही या तुलनीय चरण, फिल्म मोटाई, और जीसी कॉलम के व्यास के लिए साहित्य में पाया मूल्यों यौगिक एनोटेशन (कदम 5.4.4 और 5.4.5) के लिए विचार किया गया । सख्त मिलान मानदंड और मानकों के उपयोग के द्वारा RIs और मास स्पेक्ट्रा की पुष्टि की स्थापना के बाद, के रूप में एक मानक यौगिक के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग में बताया (कदम 5.4.7-5.4.15 और चित्रा 11), यह संभव था की पहचान की पुष्टि करने के बारे में 10 % कृ पया चयापचयों । सी explodens के प्रबंधक सामग्री के volatilome पर एक विस्तृत रिपोर्ट के बाद से कहीं प्रकाशित किया जाएगा, वर्तमान अध्ययन उन चयापचयों जो पहले से ही जोंस एट अल द्वारा पिछले एक प्रकाशन में वर्णित किया गया है पर ध्यान केंद्रित । 17 (KB02 के रूप में नामित प्रजातियों-108; यह भी कुक एट अल देखें । 23). तालिका 1 इन की पहचान यौगिकों का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक कीट aspirator के योजनाबद्ध ड्राइंग । एक ढक्कन है कि जवानों एक शीशी या कंटेनर में, दो छेद बना रहे हैं, जहां दो लचीला ट्यूबों के माध्यम से डाल रहे हैं । एक ट्यूब के उद्घाटन (T1) कि शीशी के इंटीरियर चेहरे कीड़े ब्लॉक करने के लिए काफी ठीक एक मेष के साथ बंद है । इसके अतिरिक्त, छेद ट्यूब में हवा के आदान प्रदान की सुविधा के लिए बना रहे हैं । ट्यूब टी 2 के अंत में बारीकी से कीड़ों जो aspirating T1 के माध्यम से नमूना शीशी में चूसा जाता है की ओर इशारा किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: टूटी गैस्ट्रोइसोफेजियल बनाम बरकरार । (क) अक्षुण्ण गैस्ट्रोइसोफेजियल विच्छेदन के लिए उपयुक्त. (ख) बरकरार गैस्ट्रोइसोफेजियल लगभग पूरी तरह से प्रबंधक सामग्री, विच्छेदन के लिए भी उपयुक्त से भरा है । (ग) और (घ) बाहर निकाली गई और कठोर प्रबंधक सामग्री (पीली) के साथ टूटी हुई चींटी gasters, संभवतः नमूना के दौरान गैस्ट्रोइसोफेजियल झिल्ली के टूटना के दौरान टूट गया । इन चींटियों विच्छेदन, निष्कर्षण, और आगे विश्लेषण से बाहर रखा गया है । टी: tergite । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: विच्छेदन प्रक्रिया में शामिल प्रमुख कदम । (क) चींटी के शरीर के बाकी हिस्सों से गैस्ट्रोइसोफेजियल क्षेत्र का पृथक्करण. (ख) exoskeleton बंद छीलने: tergite 1, tergite 2 (सी), और tergite 3, जिसके बाद युग्मित पीले रंग का MGRs की सामग्री लगभग पूरी तरह से दिखाई दे रहे है (डी) । (ङ) किसी विच्छेदन सुई की सहायता से स्टिकी प्रबंधकीय सामग्री को निकालना. टी: tergite । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: गैस्ट्रोइसोफेजियल की सामग्री के अलगाव के बाद चींटी । गैस्ट्रोइसोफेजियल में मौजूद दो अन्य ग्रंथियों (वी. पी.: विष ग्रंथि, और डीजी: Dufour की ग्रंथि) को देखा जा सकता है । प्रबंधक सामग्री को हटाने के बाद (वाम ओवरों के बाद अलगाव पीले रंग में देखा जा सकता है), दोनों डिब्बों अभी भी बरकरार रहना चाहिए । इन ग्रंथियों प्रबंधक सामग्री के रूप में एक ही तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि कुल आयन वर्तमान (टिक) प्रबंधक सामग्री निकालने के वर्णलेख । दो सबसे प्रचुर मात्रा में जीसी-एमएस चोटियों अधिक संतुलित आकार क्रोमेटोग्राफिक चोटियों के परिणामस्वरूप, जब एक उच्च विभाजन अनुपात (50:1) नियमित रूप से 2:1 अनुपात के बजाय चुना गया था ( इनसेटदेखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: आरआई calibrant वर्णलेख में पहले जासूस alkane का निर्धारण । सबसे पहले alkane चोटी की चोटी अधिकतम के नीचे त्रिकोण चुना गया है । alkane ६.३१ मिनट में elutes और उच्चतम स्पेक्ट्रम समानता (यहां दिखाता है, ' कल्पना. सिम. ') के लिए पुस्तकालय प्रविष्टि ' Alkane_C09 ' । alkane पहचान की पुष्टि करने के लिए, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम एक पुस्तकालय की तुलना में है (जैसे, NIST रसायन विज्ञान WebBook22). प्रस्तुत उदाहरण में, nonane एक एम के साथ अपनी आणविक आयन द्वारा की पहचान की है/१२८ के z मूल्य । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: एक n-alkane मानक मिश्रण के उपयोग के साथ आरआई अंशांकन । आरआई calibrant डेटा फ़ाइल खोला गया है और ' री-अंशांकन-जादूगर ' समारोह चुना । अंशांकन तालिका में दर्शाई गई आरआई को अवधारण समय का सही मिलान चेक किया जाना चाहिए । alkane_C09 के लिए ६.३१ मिनट के आरटी (nonane) सही ढंग से तालिका में प्रदर्शित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: गलत RTs अंशांकन तालिका में प्रदर्शित होते हैं । RTs ठीक से प्रदर्शित नहीं होते हैं (या तो एक गलत rt मान द्वारा या-1 के रूप में प्रदर्शित कोई अनुपलब्ध rt मान द्वारा दिखाया गया) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: अंशांकन तालिका में गलत RTs के मैनुअल सुधार. गलत मान मैन्युअल रूप से Alkane_C39 के लिए यहाँ दिखाए गए के रूप में संबंधित alkane के लिए सही RT सम्मिलित करके ठीक किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्रा 10: NIST-पुस्तकालय प्रविष्टियों के लिए चुना यौगिक के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम की तुलना. ६.१६ मिनट (आरआई ८९१) और ' NIST-खोज ' समारोह (लाल वृत्त), 2-heptanone के लिए ०.९९ की एक स्पेक्ट्रम समानता के सक्रियकरण पर चोटी अधिकतम eluting का चयन करने के बाद प्रदर्शित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: प्रबंधक सामग्री निकालने में Metabolite पहचान । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम और आरआई ८९१ में नमूना के वर्णलेख में यौगिक eluting से उद्भव की तुलना में घर में पुस्तकालय RIs और मापा मानक यौगिकों के स्पेक्ट्रा युक्त प्रविष्टियों के लिए कर रहे हैं । यदि ' समग्र समानता स्कोर ' (OSS, ' समग्र simil. ' के रूप में Metabolite डिटेक्टर में संक्षिप्त में एक यौगिक के बीच में घर पुस्तकालय और नमूना फ़ाइल में एक यौगिक ≥ ०.९ है, यौगिक के रूप में नामित किया गया है ' पहचान '. यहां, OSS में घर के बीच पुस्तकालय प्रविष्टि 2-heptanone और ८९१ आरआई पर यौगिक eluting ०.९६ है, जो 2 की पहचान में परिणाम-heptanone सामग्री निकालने में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12: टिक वर्णलेख वर्गों (ंयूनतम 29 से ंयूनतम ३५) के डीजी सामग्री निकालने (लाल) और प्रबंधकीय सामग्री निकालने (नीला) के ओवरले । शीर्ष क्षेत्रों अतिव्यापी (ख्यात) यौगिकों के लिए इसी में प्रबंधकीय सामग्री निकालने की तुलना में डीजी सामग्री निकालने में अधिक हैं; इन यौगिकों संभावित डीजी से उत्पंन और इसलिए के रूप में माना जाता है (लघु) प्रबंधकीय सामग्री निकालने में संदूषण । C. explodens प्रबंधक सामग्री निकालने के मामले में, एक ख्यात डीजी संदूषण से उत्पंन क्रोमेटोग्राफिक चोटियों को लगभग ंयूनतम 29 पर पाया जा सकता है, और वर्णलेख के इस भाग को प्रबंधकीय सामग्री के आगे विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 13
चित्रा 13: योजनाबद्ध कार्यप्रवाह चींटी नमूनों से metabolite एनोटेशन/GC-एमएस विश्लेषण के बाद ग्रंथि जलाशय सामग्री निष्कर्षों में पहचान । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत सभी प्रयोगात्मक चींटी और जीसी के विच्छेदन-एमएस विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डेटा मूल्यांकन के माध्यम से प्रबंधकीय सामग्री के अलगाव से शुरू कदम बताते है (काले में संकेत दिया) । एक विकल्प के रूप में, कीट स्राव भी उत्पन्न किया जा सकता है और सीटू में एकत्र (ग्रे में संकेत). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 14
चित्र 14: निष्कर्षण से पहले पृथक मोमी प्रबंधक सामग्री । (क) दो MGRs की सामग्री एक साथ रहना, लेकिन (ख) वे भी अलगाव के बाद अलग किया जा सकता है । C. explodensमें, प्रबंधकीय सामग्री का रंग नारंगी-पीला है, लेकिन COCY समूह की अंय प्रजातियों में सफेद से लेकर लाल तक हो सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 15
चित्र 15: कीट की आंतों (ब्राउन) के घटकों द्वारा एक पृथक प्रबंधकीय स्राव के पार-प्रदूषित चित्रण । इस प्रकार के प्रबंधक अलग निष्कर्षण और आगे विश्लेषण से बाहर रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Id Metabolite तुच्छ नाम InCHI स्ट्रिंग योग सूत्र
1 Heptan-2-एक InChI = 1s/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/h3-6H2, 1-2H3 ग7ज14हे
2 एन-Undecane InChI = 1s/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2, 1-2H3 C11ज24
3 एन-Heptadecane InChI = 1s/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2, 1-2H3 सी17एच३६
4 1-(2, 4, 6-Trihydroxyphenyl)-ethanone Monoacetylphloroglucinol InChI = 1s/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3-7 (8) 12/h2-3, 10-12घं, 1H3 C8ज8O4
5 5, 7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-एक Noreugenin InChI = 1s/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4, 11, 13H, 1H3 ग10ज8ओ4

तालिका 1: चयापचयों explodens लघु कार्यकर्ता चींटियों से पृथक की गई प्रबंधक सामग्री के EtOAc निकालने में पहचाना गया है । चयनित चयापचयों हैं ।

अनुपूरक आंकड़ा एस. इस पांडुलिपि में प्रस्तुत COCY चींटियों (माइनर वर्कर्स) से संबंधित सबसे महत्वपूर्ण शरीर के अंगों का अवलोकन । (क) MGRs पीले रंग में दर्शाए गए हैं. उनके gastral भाग का प्रयोग volatilome विश्लेषण के लिए किया जाता है । (ख) MGRs का gastral भाग tergites १ से ३ के नीचे स्थित है. टी: tergite । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक आंकड़ा S2 । प्रस्तुत प्रयोग के योजनाबद्ध सिंहावलोकन । चयापचयों की ख्यात पहचान तक चींटी के विच्छेदन से प्रमुख कदम सचित्र हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

इस पांडुलिपि में हम सी. explodens माइनर वर्कर चीटियों के hypertrophied MGRs में मिली सामग्री के volatilome का विश्लेषण करने के लिए एक पूरा प्रोटोकॉल पेश करते हैं । के बाद से यहां इस्तेमाल किया चींटियों विस्फोट ' कर सकते है और एक अनियंत्रित तरीके से जब संदंश के साथ छुआ में अपने प्रबंधक सामग्री बेदखल, यह एक कीट aspirator (चित्रा 1) द्वारा प्रदान के रूप में एक ' नरम संग्रह तकनीक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । COCY चींटियों सहित कुछ चींटी प्रजातियों के लिए, यह करने के लिए चींटियों की अधिकतम संख्या प्रति पांच व्यक्तियों को सीमित करने के लिए आवश्यक हो सकता है ५० मिलीलीटर की शीशी, अन्यथा स्वयं के जहर से चींटियों (जैसे, headspace में फार्म का एसिड के संचय) हो सकता है. क्षेत्र में चींटियों ठंड के लिए, एक शांत गहरे जमे हुए ठंडे पैक के साथ भरवां बैग इस्तेमाल किया जा सकता है । नमूनों तेजी से जमे हुए और ठंडा शर्तों के तहत संग्रहित किया जाना चाहिए (जैसे, -20 डिग्री सेल्सियस, सबसे अच्छा पर-८० ° c), लेकिन यह मारने के लिए अनुशंसित नहीं है और तरल नाइट्रोजन में चींटियों की दुकान, के बाद से उनकी ग्रंथियों की वृद्धि हुई क्षति इस विधि के साथ मनाया गया है ।

प्रस्तुत बफर और विलायक मुक्त विच्छेदन पद्धति मोम की तरह mandibular ग्रंथि जलाशय सामग्री प्राप्त करने के साथ ही अंय जमे हुए कार्यकर्ता चींटियों में मौजूद ग्रंथियों के लिए उपयुक्त है । C. explodensके प्रबंधकीय सामग्री के volatilome विश्लेषण के लिए, प्रमुख पहलुओं में विच्छेदन के दौरान विचार किया जा चींटी (कदम 2.1.4) के निरंतर ठंडा कर रहे है और अंय ग्रंथि सामग्री के साथ मिलीग्राम के नमूनों के पार-संदूषणों/ चींटी गैस्ट्रोइसोफेजियल (चरण २.५, चित्रा 4, और चित्रा 15) । जमे हुए चींटियों के एक काफी अंश क्षतिग्रस्त हो सकता है, या तो क्योंकि चींटियों ' विस्फोट ' नमूने के दौरान या नमूना साइट से प्रयोगशाला में सूखी बर्फ पर परिवहन के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया । यदि गैस्ट्रोइसोफेजियल क्षेत्र टूट जाए तो आगे के विश्लेषण के लिए ये चींटियाँ उपयुक्त नहीं हैं (चित्र 2cडी). यदि केवल एंटीना और पैर गायब या टूट रहे हैं, इन चींटियों अभी भी प्रबंधकीय सामग्री और आगे विश्लेषण के निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कूल्ड सी. explodens चींटियों के प्रबंधक सामग्री के बाद से एक मोम-निरंतरता की तरह यह सीधे उन्हें विच्छेदन सुई के उपयोग के साथ अलग करने के लिए आगे है (चरण २.५, चित्रा 3E, और 14 चित्रा). स्टिकी प्रबंधकीय सामग्री को संभालते समय अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता है । यह कुछ भी शारीरिक संपर्क में आने के लिए छड़ी कर सकते हैं और अक्सर विच्छेदन संदंश का पालन करेंगे, जो अन्य नमूनों के संदूषण का खतरा बढ़ जाता है. यह केवल विच्छेदन सुई के साथ प्रबंधक सामग्री को छूने और तुरंत इसे निकालने के लिए इस्तेमाल किया कांच शीशियों में स्थानांतरण करने के लिए आवश्यक है (चरण २.५ और २.६). इसके अलावा, यह एक MeOH/एच2ओ मिश्रण जब चींटियों या ग्रंथि-प्रकार (चरण २.८) के बीच स्विचन के साथ विच्छेदन उपकरण साफ करने के लिए सिफारिश की है ।

अंय चींटी प्रजातियों की थाइराइड सामग्री भी ठंडे पैक के साथ ठंडा करने के दौरान एक तरल अवस्था में मौजूद हो सकता है । इस मामले में, झिल्ली सहित पूरी ग्रंथि पहले अलग किया जा सकता है और बाद में पंचर सामग्री प्राप्त करने के लिए । तरल स्राव भी ठीक केशिका पिपेट की मदद से प्राप्त किया जा सकता है । के बारे में 4-5 मिमी की एक औसत शरीर की लंबाई के साथ (एंटेना के बिना), C. explodens के श्रमिकों COCY समूह की छोटी प्रजातियों के हैं. उनकी अक्सर सूजन गैस्ट्रोइसोफेजियल के बारे में 2-लंबाई में 2.5 मिमी और चौड़ाई में 1-1.5 मिमी शामिल हैं । COCY समूह की अब तक की सबसे बड़ी ज्ञात प्रजातियों के श्रमिक लंबाई में लगभग 3 मिमी के एक गैस्ट्रोइसोफेजियल आकार और चौड़ाई में २.५ मिमी के साथ शरीर की लंबाई में लगभग 8 मिमी का एक आकार तक पहुँच सकते हैं । चूंकि प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काटना और व्यक्तिगत चींटियों और अलग COCY प्रजातियों के उस आकार के gasters की जांच करने के लिए अनुकूल है, यहां इस्तेमाल किया विच्छेदन उपकरणों और माइक्रोस्कोप के लिए छोटे चींटियों या छोटे अंगों के लिए लागू होने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा, विश्लेषणात्मक नमूना प्रति चींटियों की संख्या के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि हो सकती है ।

जबकि प्रबंधकीय सामग्री के लिए चींटी विदारक, यह महत्वपूर्ण है किसी भी अंय ग्रंथियों या आंतों को नुकसान नहीं-की सामग्री है जो नमूना पार-दूषित हो सकता है (चरण २.५, चित्रा 4 और चित्रा 15) । इष्टतम मामले में, प्रबंधकीय सामग्री, महानिदेशक, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वी. आर. के निष्कर्षण के बाद बरकरार रखा जाता है (चित्रा 4) । डीजी की सामग्री के साथ संदूषण, जो MGRs के नीचे स्थित है, पूरी तरह से बचना मुश्किल है । इस के लिए कारण भी प्रयोगशाला के लिए नमूना-साइट से सूखी बर्फ पर परिवहन के दौरान ग्रंथि अखंडता के आंशिक व्यवधान शामिल हो सकते हैं । यह भी संभव है कि DGs नमूने के दौरान या विस्फोट की प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त हो, के रूप में हम जांच की चींटियों की संख्या में प्रबंधक के लिए देखा है । चूंकि डीजी सामग्री का विश्लेषण उसी तरह किया जा सकता है, जब प्रबंधकीय सामग्री (अनुभाग 3 और 4) के रूप में, परिणाम प्रबंधकीय सामग्री नमूनों (धारा 6) के विश्लेषण के बाद परिणामी डेटा की तुलना में हो सकते हैं । सी explodens चींटियों से प्राप्त प्रबंधकीय सामग्री निष्कर्षों के मामले में, यौगिकों भी डीजी में निहित वर्णलेख (12 अंक) में देर elute शुरू करते हैं । प्रबंधकीय घटकों के लिए, संबंधित चयापचयों को ओवरटेक करने से रोकने के लिए आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है । अंय चींटी प्रजातियों पर अध्ययन से यह ज्ञात है कि DGs भी (उच्च) वाष्पशील यौगिकों1,24, जो आम तौर पर GC-वर्णलेख में जल्दी elute में शामिल कर सकते हैं ।

पिछले COCY चींटियों की प्रबंधकीय सामग्री की रासायनिक संरचना से निपटने के अध्ययन में, पूरे चींटियों या उनके पूरे gasters16,17,18,23का विश्लेषण किया गया, जबकि यहां प्रबंधक सामग्री खुद को चींटियों के विच्छेदन के माध्यम से प्राप्त किया गया ।

विच्छेदित प्रबंधकीय सामग्री का विश्लेषण करने से जांचकर्ताओं को उसमें निहित चयापचयों की पहचान सहित जैव रासायनिक अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शित करने की अनुमति मिलती है । यहाँ किया गया अध्ययन के बाद से explodensके प्रबंधक में निहित अस्थिर घटकों की पहचान पर ध्यान केंद्रित, जीसी-MS अपने विश्लेषण (धारा 4) के लिए चुना गया था । इस के लिए, अर्क आदर्श तुरंत तैयारी के बाद मापा जाना चाहिए या में संग्रहित-८० ° c विश्लेषण तक । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि (विस्तारित) भंडारण के अर्क के रासायनिक परिवर्तन का कारण हो सकता है (३.३ और ४.२ कदम के बाद नोट देखें) । चूंकि प्रबंधकीय सामग्री की एकाग्रता परिमाण के कई आदेशों की एक सीमा को कवर कर सकते हैं, यह अलग GC विभाजन अनुपात में प्रबंधक निष्कर्षों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हो सकता है । के बाद से दो मुख्य यौगिकों उदाहरण देना के लिए ले लिया चींटियों की सामग्री निकालने के कारण स्तंभ ओवरलोडिंग जब 2:1 के एक विभाजित अनुपात का उपयोग किया गया था, इस नमूने 50:1 (चरण 4.3.1.2 और चित्रा 5) के एक उच्च विभाजन अनुपात में दूसरी बार विश्लेषण किया गया था. gc-ms पैरामीटर सेटिंग्स खंड 4 में प्रस्तुत की सामग्री की तालिकामें निर्दिष्ट gc-ms डिवाइस के साथ उत्पन्न डेटा के लिए उपयुक्त हैं । इसके बाद आरआई calibrants (कदम शुू) में, एक विलायक रिक् त (step 4.1.2) को अनुवर्ती डाटा विश्लेषण के दौरान गैर-जैविक कलाकृतियों और संदूषणों को पहचानने के लिए भी विश्लेषण किया जाना चाहिए । metabolite पहचान के लिए, यह भी नमूना निष्कर्षों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल के रूप में एक ही GC-MS शर्तों के तहत व्याख्या यौगिकों के प्रामाणिक मानकों को मापने के लिए महत्वपूर्ण है (कदम 5.4.7 और निम्न). सटीकता और अंतिम डेटा की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए, यह एक ही माप अनुक्रम के भीतर सभी नमूना श्रेणियों (विलायक रिक्त, आरआई calibrants, नमूना निष्कर्षों, और मानकों) का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा, प्रामाणिक मानकों एक नमूना निष्कर्षों के लिए मनाया कि तुलनीय एकाग्रता पर विश्लेषण किया जाना चाहिए. यह आरआई मूल्यों और नमूना और मानक मास स्पेक्ट्रा, जो अंततः वृद्धि हुई है और अधिक सार्थक metabolite एनोटेशन/पहचान के लिए नेतृत्व करेंगे के बीच समानता की सटीकता को बढ़ाने में मदद करता है । इस अंत करने के लिए, मानकों को बार अलग विभाजन कारकों का उपयोग कर मापा जा सकता है ।

metabolite पहचान के लिए, परिष्कृत सॉफ्टवेयर, MetaboliteDetector स्पेक्ट्रा deconvolution और आरआई और स्पेक्ट्रा तुलना के लिए एक कार्यांवित NIST-पुस्तकालय के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक स्थापित में घर पुस्तकालय (खंड 5) के लिए प्रयोग किया जाता है । यह एक ६४ बिट LINUX-आधारित ऑपरेटिंग सिस्टम (जैसे, KUBUNTU) पर MetaboliteDetector चलाने के लिए और उत्पंन * प्रतिलिपि करने के लिए सिफारिश की है । CDF डेटा फ़ाइलें (चरण ४.४) पोर्टेबल डेटा संग्रहण डिवाइस से स्थानीय हार्ड ड्राइव पर । MetaboliteDetector केन्द्रक या प्रोफ़ाइल netCDF प्रारूप में रॉ GC-एमएस डेटा आयात करने में सक्षम है । सबसे GC-एमएस उपकरणों के सॉफ्टवेयर इस प्रारूप19में दर्ज कच्चे डेटा को बदलने में सक्षम होना चाहिए । डेटा विश्लेषण शुरू करने से पहले, यह अत्यधिक सुविधाओं और ग्राफिकल यूजर इंटरफेस19,25, के साथ परिचित बनने के लिए पिछले MetaboliteDetector सॉफ्टवेयर संस्करणों के लिए उपलब्ध साहित्य को पढ़ने के लिए सिफारिश की है 26.

आरआई अंशांकन और अनुवर्ती आरआई नमूना निष्कर्षों, RIs और calibrants के स्पेक्ट्रा (यहां, एन-alkanes) में मौजूद चोटियों की एक पुस्तकालय का उपयोग किया जाता है में उपस्थित शिखर की गणना के लिए । इस तरह के एक पुस्तकालय या तो स्वयं किया जा सकता है, या एक मौजूदा एक (' CalibrationLibrary_Alkanes ')27डाउनलोड किया जा सकता है । प्रदान की गई डिफ़ॉल्ट calibrant लायब्रेरी में RIs और स्पेक्ट्रा n-alkanes के लिए C09 से लेकर C39 जो खंड 4 में वर्णित के रूप में विश्लेषण किया गया है । प्रदान की गई लाइब्रेरी Metabolite डिटेक्टर के साथ काम कर रहे उपयोगकर्ताओं को सीधे अपने डेटा के अंशांकन प्रक्रिया के साथ शुरू करने के लिए सक्षम बनाता है । यदि आवश्यक हो, इस पुस्तकालय भी आगे alkanes के लिए अतिरिक्त प्रविष्टियों के साथ बढ़ाया जा सकता है । संदर्भ की समानता और प्रयोग के आधार पर RIs और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा व्युत्पंन (५.३ कदम देखें और उप कदम, चित्रा 7, चित्रा 8, चित्रा 9), एनोटेशन या यौगिकों की पहचान प्रदर्शन किया जा सकता है (चरण ५.४ और उप कदम, चित्र 11) । यह भी महत्वपूर्ण है कि MetaboliteDetector के साथ स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग के बाद, उपयोगकर्ता के लिए मैंयुअल रूप से सही पीक उठा और स्पेक्ट्रम deconvolution के लिए जांच करेंगे ' त्रिकोण ' ब्याज की प्रत्येक ख्यात परिसर के लिए अंतर्निहित स्पेक्ट्रा का निरीक्षण । इसके अलावा, GC-MS इंस्ट्रूमेंटेशन और डेटा जनरेशन के लिए प्रयुक्त पैरामीटर सेटिंग के आधार पर, प्रस्तुत MetaboliteDetector सेटिंग्स के रूपांतरों आवश्यक हो सकता है । MetaboliteDetector सॉफ्टवेयर इस पांडुलिपि में समझाया से कई और अधिक उपयोगी आपरेशन प्रदर्शन करने में सक्षम है, उदाहरण के लिए , निकाले आयन वर्तमान (EIC) chromatograms, के रूप में chromatograms के निर्यात के प्रदर्शन. csv, स्वत: बैच-ठहराव के यौगिकों, और कई और अधिक ।

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल अंय शोधकर्ताओं द्वारा किए गए प्रयोगों के लिए सुझाव के रूप में सेवा कर सकते ग्रंथियों या कीड़ों से ग्रंथि सामग्री के अलगाव पर ध्यान केंद्रित, volatilome विश्लेषण, साथ ही साथ metabolite पहचान ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के लिए फंडिंग वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF) LS13-048 को आईएसडी के माध्यम से प्राप्त किया गया था । विशेष धंयवाद Diane डब्ल्यू डेविडसन (यूटा विश्वविद्यालय; अब सेवानिवृत्त) हमारे साथ Bornean COCY चींटियों के बारे में अपने ज्ञान बांटने के लिए जाओ । हम Belalong क्षेत्र अध्ययन केंद्र (KBFSC) और Universiti ब्रुनेई दारुसलाम (UBD) के प्रशासन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ब्रुनेई वानिकी विभाग और ब्रुनेई अनुसंधान और नवाचार केंद्र के लिए अनुमति के लिए चींटियों इकट्ठा करने के लिए की सराहना करते है और अनुमोदन और निर्यात परमिट जारी । विशेष धंयवाद UBD और KBFSC स्टाफ, विशेष रूप से मुहंमद बनाएँ बिन अब्दुल्ला चमगादड़, टेडी Chua छोटा ली, Masnah Mirasan, Rafhiah कहार, Roshanizah Rosli, Rodzay वहाब, चान चिन मेई, और कुषाण टेंकों हमारे शोध को सुविधाजनक बनाने के लिए जाओ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP Sarstedt 62,559,001 see Figure 1 in manuscript
PVC Tubings Rehau 290 4489 see Figure 1 in manuscript
Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size Antstore 1000378 see Figure 1 in manuscript
Freezer Severin KS 9890  -20 °C or lower
polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm Thorsten Koch 4260308590481
Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm Aldrich BR455742
Cold pack 150 mm x 100 mm Elite Bags 1998 freeze to -20 °C
Bucket with crushed ice
1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening La-Pha-Pack 11090500
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm La-Pha-Pack 9151799
Stereomicroscope Bresser 5806100
Forceps, Superfine Tip curved Medizinische Instrumente May, Norman May PI-0005B
Forceps, Superfine Tip straight blueINOX BL-3408
Dissection needle 140 mm, pointed, straight Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110301
Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën fisher scientific 15654740
Distilled water
Rotizell-Tissue-Tücher Carl Roth GmbH + Co.KG 0087.2
Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % Carl Roth GmbH + Co.KG 4442.1 freeze to -20 °C
Vortex Genie 2 neoLab 7-0092
0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip  La-Pha-Pack 06090357
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum,  45° shore A, 1.0 mm La-Pha-Pack 9151819
Alkane standard solution C8-C20 Sigma-Aldrich  04070
Alkane standard solution C21-C40 Sigma-Aldrich  04071
n-Hexane SupraSolv Merck 104371
GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister Gerstel
Agilent Gas chromatograph 6890 N Agilent
Gooseneck splitless Liner Restek 22406
Helium (5.0 - F50) Messer 102532501
GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm Agilent 19091S-433UI
Agilent Mass Selective Detector 5975B Agilent
MSD ChemStation Data Analysis Application software  Agilent
MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
Calibration Library for MetaboliteDetector Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
MD Conversion Tool for NIST-library Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक १३८ उष्णकटिबंधीय चींटियों Colobopsis cylindrica समूह Colobopsis explodens mandibular ग्रंथि विच्छेदन निष्कर्षण गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री metabolomics volatilome MetaboliteDetector
GC-MS और MetaboliteDetector द्वारा Volatilome विश्लेषण के लिए ' Bornean विस्फोट चींटियों ' (<em>Formicidae</em>) से Mandibular ग्रंथि जलाशय सामग्री का अलगाव
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Hoenigsberger, M., Kopchinskiy, A.… More

Hoenigsberger, M., Kopchinskiy, A. G., Parich, A., Hiller, K., Laciny, A., Zettel, H., Lim, L. B. L., Salim, K. A., Druzhinina, I. S., Schuhmacher, R. Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector. J. Vis. Exp. (138), e57652, doi:10.3791/57652 (2018).

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