Protocolo para crear heridas crónicas en ratones diabéticos

Summary

Las heridas crónicas se desarrollan a partir de heridas agudas en un modelo de ratón diabético induciendo altos niveles de estrés oxidativo después de una herida cutánea de espesor completo. La herida se trata con inhibidores de la catalasa y glutatión peroxidasa, lo que resulta en un deterioro de la cicatrización y el desarrollo de biopelículas por bacterias presentes en el microbioma de la piel.

Abstract

Las heridas crónicas se desarrollan como resultado de una regulación defectuosa en uno o más procesos celulares y moleculares complejos involucrados en la curación adecuada. Afectan a 6,5 millones de personas y cuestan 40 millones de euros al año solo en los EE. UU. Aunque se ha invertido un esfuerzo significativo en entender cómo se desarrollan las heridas crónicas en los seres humanos, las preguntas fundamentales siguen sin respuesta. Recientemente, desarrollamos un novedoso modelo de ratón para heridas crónicas diabéticas que tienen muchas características de heridas crónicas humanas. Usando ratones db/db^-/-, podemos generar heridas crónicas induciendo altos niveles de estrés oxidativo (OS) en el tejido de la herida inmediatamente después de la herida, utilizando un tratamiento único con inhibidores específicos de las enzimas antioxidantes catalasa y glutatión peroxidasa. Estas heridas tienen altos niveles de Sistema Operativo, desarrollan biofilm de forma natural, se vuelven completamente crónicas dentro de los 20 días después del tratamiento y pueden permanecer abiertas durante más de 60 días. Este nuevo modelo tiene muchas características de las heridas crónicas diabéticas en los seres humanos y por lo tanto puede contribuir significativamente a avanzar en la comprensión fundamental de cómo las heridas se vuelven crónicas. Este es un gran avance porque las heridas crónicas en los seres humanos causan dolor significativo y angustia a los pacientes y resultan en la amputación si no se resuelven. Además, estas heridas son muy costosas y requieren mucho tiempo de tratar, y conducen a una pérdida significativa de ingresos personales para los pacientes. Los avances en este campo de estudio a través del uso de nuestro modelo de heridas crónicas pueden mejorar significativamente la atención médica para millones de personas que sufren bajo esta condición debilitante. En este protocolo, describimos con gran detalle el procedimiento para hacer que las heridas agudas se vuelvan crónicas, lo que no se ha hecho antes.

Introduction

La cicatrización de heridas implica procesos celulares y moleculares complejos que están regulados temporal y espacialmente, organizados en etapas secuenciales y superpuestas que involucran muchos tipos de células diferentes, incluyendo pero no limitado a la respuesta inmune y la sistema¹. Inmediatamente después de que la piel sufre una lesión, los factores y las células sanguíneas se agregan al sitio de la herida e inician la cascada de coagulación para formar un coágulo. Después de que se logra la homeostasis, los vasos sanguíneos se dilatan para dejar entrar en el sitio de la herida oxígeno, nutrientes, enzimas, anticuerpos y factores quimiotácticos que quimioaparalan polimorproucleocitos para limpiar el lecho de la herida de desechos extraños y secretar enzimas proteolíticas ^2.Las plaquetas activadas secretan una variedad de factores de crecimiento para estimular los queratinocitos en el borde de la herida para reepitelizar la zona herida. Los monocitos reclutados en el sitio de la herida diferencian en macrófagos que las bacterias fagocitosas y los neutrófilos muertos y secretan factores adicionales para mantener las señales proliferativas y pro-migratorias de queratinocitos. En la fase de proliferación, mientras continúa la reepitelización, el proceso de reconstrucción de nuevos tejidos de granulación compuestos de fibroblastos, monocitos/macrofagos, linfocitos y células endoteliales continúan el proceso de reconstrucción^2. La angiogénesis se estimula promoviendo la proliferación y migración de células endoteliales, lo que resulta en el desarrollo de nuevos vasos. La epitelización y remodelación de la matriz extracelular construyen una barrera contra el medio ambiente. A medida que la herida se cura y el tejido de granulación evoluciona hacia una cicatriz, la apoptosis elimina las células inflamatorias, los fibroblastos y las células endoteliales sin causar daño adicional en los tejidos. La resistencia a la tracción del tejido se ve reforzada por la remodelación de fibroblastos de varios componentes de la matriz extracelular, como el colágeno, por lo que el tejido recién formado es casi tan fuerte y flexible como la piel no herida^2.

Cualquier desviación de esta progresión altamente concertada hacia el cierre de la herida conduce a heridas deterioradas y/o crónicas³. Las heridas crónicas se caracterizan por un aumento del estrés oxidativo, inflamación crónica, microvasculatura dañada y matriz de colágeno anormal en la herida^4. El estrés oxidativo, especialmente en la herida, puede retrasar el cierre de la herida^2,5. Cuando, en la primera etapa de la cicatrización de heridas, la fase inflamatoria se vuelve no regulada, el tejido huésped asume un daño extenso debido a una continua afluencia de células inflamatorias⁵ que liberan enzimas citotóxicas, un aumento de los radicales de oxígeno libre, y mediadores inflamatorios no regulados, resultando en la muerte celular^6,7.

En este microambiente destructivo, las bacterias formadoras de biopelículas aprovechan los nutrientes del huésped y contribuyen al daño del tejido huésped². Estas biopelículas son difíciles de controlar y eliminar porque las sustancias poliméricas extracelulares hidratadas compuestas de proteínas, ADN, ARN y polisacáridos permiten que las bacterias que se encuentran en su interior sean tolerantes a las terapias antibióticas convencionales y evadan la respuesta inmune innata y adaptativa del huésped^2,8,9.

El estudio de las heridas crónicas es crucial porque afectan a 6,5 millones de personas y cuestan 40.000 millones de dólares al año solo en los Estados Unidos¹⁰. Los pacientes con diabetes tienen mayores riesgos de desarrollar heridas crónicas que requieren amputación para contener la propagación de la infección. Estos pacientes tienen un riesgo de mortalidad del 50% dentro de los 5 años siguientes a la amputación que se atribuye al mecanismo de fisiopatología de la diabetes^11. La relación entre el sistema inmunitario del huésped y el microbioma en la cicatrización de heridas es un tema vital de la investigación en curso porque las consecuencias de las heridas crónicas, si no se resuelven, incluyen la amputación y la muerte^12.

Aunque se ha invertido un esfuerzo significativo en la comprensión de cómo se desarrollan las heridas crónicas en los seres humanos, todavía no está claro cómo y por qué se forman heridas crónicas. Los experimentos para estudiar los mecanismos de curación deteriorada son difíciles de llevar a cabo en seres humanos, y los especialistas en curación de heridas solo ven pacientes con heridas crónicas que ya han alcanzado la cronicidad durante semanas o meses. Por lo tanto, los especialistas son incapaces de estudiar qué procesos salieron mal que llevan a que la herida se desarrolle para convertirse en crónica². Hay una falta de modelos animales que recapitulen la complejidad de las heridas crónicas humanas. Hasta que nuestro modelo fue desarrollado, no existía ningún modelo para estudios crónicos de heridas.

El modelo de herida crónica se desarrolló en ratones que tienen una mutación en el receptor de leptina (db/db^-/-)¹³. Estos ratones son obesos, diabéticos y tienen deterioro de la cicatrización, pero no desarrollan heridas crónicas^14. Niveles de glucosa en sangre en promedio alrededor de 200 mg/dL, pero puede ser tan alto como 400 mg/dL¹⁵. Cuando se inducen altos niveles de estrés oxidativo (SA) en el tejido de la herida inmediatamente después de la herida, la herida se vuelve crónica^16. Las heridas db/db^-/- se consideran crónicas por 20 días y permanecen abiertas durante 60 días o más. Biofilm producido por bacterias se puede ver desarrollándose a partir de tres días después de la herida; una biopelícula madura se puede ver 20 días después de la herida y persiste hasta el cierre de la herida. Las bacterias formadoras de biopelículas que encontramos en estos ratones también se encuentran en heridas crónicas diabéticas humanas.

El estrés oxidativo es inducido por el tratamiento de las heridas con dos inhibidores de enzimas antioxidantes, catalasa y glutatión peroxidasa, dos enzimas con la capacidad de descomponer el peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno es una especie reactiva de oxígeno y puede causar daño celular a través de la oxidación de proteínas, lípidos y ADN. La catalasa cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en sustancias químicas menos dañinas oxígeno y agua. 3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ) inhibe la catalasa uniéndose específicamente y covalentemente al centro activo de la enzima, inactivando^17,18,19. ATZ se ha utilizado para estudiar los efectos del estrés oxidativo in vitro e in vivo a través de la inhibición de la catalasa^{20,21,22,23,24}. Glutathione peroxidase cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno a través del antioxidante, glutatión, y es una enzima importante que protege la célula contra el estrés oxidativo^25. El ácido mercaptosuccinico (MSA) inhibe la glutatión peroxidasa uniéndose al sitio activo de selenocisteína de la enzima con tiol, inactivando²⁶. MSA se ha utilizado para estudiar los efectos del estrés oxidativo in vitro e in vivo así^20,27,28.

Este novedoso modelo de heridas crónicas es un modelo poderoso para estudiar porque comparte muchas de las mismas características observadas en las heridas crónicas diabéticas humanas, incluyendo la inflamación prolongada por el aumento del sistema operativo y la formación de biopelícula natural a partir del microbioma de la piel. Las heridas han deteriorado la interacción dérmica-epidérmica, la deposición anormal de la matriz, la mala angiogénesis y la vasculatura dañada. Las heridas crónicas se desarrollarán tanto en ratones masculinos como femeninos, por lo que ambos sexos se pueden utilizar para estudiar heridas crónicas. Por lo tanto, el modelo de herida crónica puede contribuir significativamente a avanzar en la comprensión fundamental de cómo comienzan tales heridas. El uso de este modelo de herida crónica puede proporcionar respuestas a preguntas fundamentales sobre cómo se inicia / logra la cronicidad a través de contribuciones de la fisiología de la cicatrización de heridas deterioradas y el microbioma del huésped.

Protocol

Todos los experimentos se completaron de acuerdo con las regulaciones federales y las políticas y procedimientos de la Universidad de California han sido aprobados por la Universidad de California, Riverside IACUC. 1. Animal Use B6 diabético y obeso. BKS(D)-Ratones Leprdb/J para el modelo de herida crónica. Las opciones de compra incluyen heterocigotos para la cría o homocigotos directamente para experimentos. Criar machos y hembras heterocigotos par…

Representative Results

La Figura 5 muestra un ejemplo de una herida sin tratamiento de inhibidores que progresan hacia el cierre de la herida y una herida con tratamiento de inhibidores que progresan hacia la cronicidad. El apósito transparente se ha dejado en su lugar en la herida crónica para que se pueda ver la biopelícula y la acumulación de líquido. El inicio crónico de la herida tiene lugar en menos de 6 horas…

Discussion

Una vez que se crean heridas crónicas en ratones, el modelo se puede utilizar para estudiar los procesos de cicatrización de heridas deteriorados involucrados en el inicio de la cronicidad. El modelo también se puede utilizar para probar la eficacia de una amplia gama de productos químicos y medicamentos que pueden revertir el desarrollo de heridas crónicas y la cicatrización deteriorada y conducir al cierre y la cicatrización de la herida. Se pueden estudiar diferentes puntos de tiempo después de la aparición d…

Materials

B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers