Protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris diabétiques

Summary

Les blessures chroniques sont développées des blessures aigues sur un modèle diabétique de souris en induisant des niveaux élevés de stress oxydatif après une blessure cutanée pleine épaisseur. La plaie est traitée avec des inhibiteurs pour la catalase et le peroxidase de glutathion, ayant pour résultat la guérison altérée et le développement de biofilm par les bactéries présentes dans le microbiome de peau.

Abstract

Les blessures chroniques se développent à la suite d’une régulation défectueuse dans un ou plusieurs processus cellulaires et moléculaires complexes impliqués dans une bonne guérison. Ils ont un impact de 6,5 millions d’euros et coûtent 40 milliards de dollars par an aux États-Unis seulement. Bien qu’un effort important ait été investi pour comprendre comment les blessures chroniques se développent chez l’homme, des questions fondamentales restent sans réponse. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de souris pour les plaies chroniques diabétiques qui ont de nombreuses caractéristiques des blessures chroniques humaines. En utilisant db/db^-/- souris, nous pouvons générer des blessures chroniques en induisant des niveaux élevés de stress oxydatif (OS) dans le tissu de la plaie immédiatement après la blessure, en utilisant un traitement unique avec des inhibiteurs spécifiques aux enzymes antioxydantes catalase et peroxidase de glutathion. Ces plaies ont des niveaux élevés de système d’exploitation, développent le biofilm naturellement, deviennent entièrement chroniques dans les 20 jours après le traitement et peuvent rester ouvertes plus pendant plus de 60 jours. Ce nouveau modèle a beaucoup de dispositifs des blessures chroniques diabétiques chez l’homme et peut donc contribuer de manière significative à faire progresser la compréhension fondamentale de la façon dont les blessures deviennent chroniques. Il s’agit d’une percée majeure parce que les blessures chroniques chez l’homme causent une douleur et une détresse importantes aux patients et entraînent une amputation si elles ne sont pas résolues. De plus, ces blessures sont très coûteuses et prennent beaucoup de temps à traiter et entraînent une perte importante de revenu personnel pour les patients. Les progrès dans ce domaine d’étude grâce à l’utilisation de notre modèle de plaie chronique peuvent améliorer considérablement les soins de santé pour des millions de personnes qui souffrent de cette maladie débilitante. Dans ce protocole, nous décrivons en détail la procédure pour causer des blessures aigues pour devenir chronique, qui n’a pas été faite avant.

Introduction

La cicatrisation des plaies implique des processus cellulaires et moléculaires complexes qui sont réglés temporellement et spatialement, organisés en étapes séquentielles et qui se chevauchent, qui impliquent de nombreux types de cellules différentes, y compris, mais sans s’y limiter, la réponse immunitaire et le vasculaire système¹. Immédiatement après que la peau supporte une blessure, les facteurs et les cellules sanguines s’agrégent au site de la plaie et initient la cascade de coagulation pour former un caillot. Après l’homéostasie est atteint, les vaisseaux sanguins se dilatent pour laisser entrer l’oxygène du site de la plaie, les nutriments, les enzymes, les anticorps et les facteurs chimiotactiques qui chemoattract polymorphonucléocytes pour effacer le lit de blessure de débris étrangers et sécréter des enzymes protéolytiques ². Les plaquettes activées sécrètent une variété de facteurs de croissance pour stimuler les kératinocytes au bord de la plaie pour réépithéhélier la zone blessée. Les monocytes recrutés sur le site de la plaie se différencient en macrophages qui phagocytose les bactéries et les neutrophiles morts et sécrètent des facteurs supplémentaires pour maintenir la prolifération des kératinocytes et les signaux pro-migrateurs. Dans la phase de prolifération, tandis que la réépithélialisation continue, le nouveau tissu de granulation composé des fibroblastes, des monocytes/macrophages, des lymphocytes, et des cellules endothéliales continuent le processus de reconstruction^2. L’angiogenèse est stimulée par la promotion de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales, ce qui entraîne le développement de nouveaux vaisseaux. L’épithélialisation et le remodelage de la matrice extracellulaire construisent une barrière contre l’environnement. Comme la plaie guérit et le tissu de granulation évolue en cicatrice, l’apoptose élimine les cellules inflammatoires, les fibroblastes et les cellules endothéliales sans causer de dommages supplémentaires aux tissus. La force de tension du tissu est augmentée par des fibroblastes transformant divers composants de la matrice extracellulaire, comme le collagène, de sorte que le tissu nouvellement formé soit presque aussi fort et flexible que la peau non blessée^2.

Toute déviation de cette progression très concertée vers la fermeture des plaies conduit à des blessures altérées et/ou chroniques³. Les blessures chroniques sont caractérisées par l’effort oxydant accru, l’inflammation chronique, la microvasculature endommagée, et la matrice anormale de collagène dans la blessure^4. Le stress oxydatif, particulièrement dans la blessure, peut retarder la fermeture de blessure^2,5. Lorsque, dans la première étape de la cicatrisation des plaies, la phase inflammatoire devient non réglementée, le tissu hôte assume des dommages importants dus à un afflux continu de cellules inflammatoires⁵ qui libèrent des enzymes cytotoxiques, une augmentation des radicaux libres d’oxygène, et médiateurs inflammatoires non réglementés, entraînant la mort cellulaire^6,7.

Dans ce microenvironnement destructeur, les bactéries qui forment des biofilms tirent parti des nutriments de l’hôte et contribuent aux dommages du tissu hôte². Ces biofilms sont difficiles à contrôler et à éliminer parce que les substances polymères extracellulaires hydratées composées de protéines, d’ADN, d’ARN et de polysaccharides permettent aux bactéries hébergées à l’intérieur d’être tolérantes aux thérapies antibiotiques conventionnelles et d’éviter le réponse immunitaire innée et adaptative de l’hôte^2,8,9.

L’étude des plaies chroniques est cruciale parce qu’elles ont un impact de 6,5 millions de personnes et coûtent 40 milliards de dollars par an aux États-Unis seulement¹⁰. Les patients atteints de diabète ont des risques accrus de développer des plaies chroniques qui nécessitent une amputation afin de contenir la propagation de l’infection. Ces patients ont un risque de mortalité de 50% dans les 5 ans de l’amputation qui est attribué au mécanisme de pathophysiologie du diabète¹¹. La relation entre le système immunitaire de l’hôte et le microbiome dans la cicatrisation des plaies est un sujet vital de la recherche en cours parce que les conséquences des blessures chroniques, si elles ne sont pas résolues, comprennent l’amputation et la mort¹².

Bien qu’un effort significatif ait été investi dans la compréhension de la façon dont les blessures chroniques se développent chez l’homme, on ne sait toujours pas comment et pourquoi les blessures chroniques se forment. Les expériences visant à étudier les mécanismes de guérison altérée sont difficiles à mener chez l’homme, et les spécialistes de la cicatrisation des plaies ne voient que les patients atteints de plaies chroniques qui ont déjà atteint la chronique pendant des semaines à des mois. Ainsi, les spécialistes sont incapables d’étudier quels processus ont mal tourné qui conduisent la plaie à se développer pour devenir chronique². Il y a un manque de modèles animaux qui récapitulent la complexité des blessures chroniques humaines. Jusqu’à ce que notre modèle ait été développé, aucun modèle pour des études chroniques de blessure n’a existé.

Le modèle de blessure chronique a été développé chez les souris qui ont une mutation dans le récepteur de leptine (db/db^-/-)¹³. Ces souris sont obèses, diabétiques, et ont altéré la guérison, mais ne développent pas de blessures chroniques¹⁴. Les niveaux de glucose sanguin sont en moyenne d’environ 200 mg/dl, mais peuvent atteindre 400 mg/dl¹⁵. Lorsque des niveaux élevés de stress oxydatif (OS) dans le tissu de la plaie sont induits immédiatement après la blessure, la plaie devient chronique¹⁶. Les plaies db/db^-/- sont considérées comme chroniques de 20 jours et restent ouvertes pendant 60 jours ou plus. Biofilm produit par des bactéries peut être vu se développer à partir de trois jours après la blessure; un biofilm mature peut être vu 20 jours après la blessure et persiste jusqu’à la fermeture de la plaie. Les bactéries biofilm-formant que nous trouvons dans ces souris sont également trouvées dans les blessures chroniques diabétiques humaines.

Le stress oxydatif est induit par le traitement des plaies avec deux inhibiteurs des enzymes antioxydantes, la catalase et le peroxidase de glutathion, deux enzymes avec la capacité de décomposer le peroxyde d’hydrogène. Le peroxyde d’hydrogène est une espèce réactive d’oxygène et peut causer des dommages cellulaires par l’oxydation des protéines, des lipides, et de l’ADN. La catalase catalyse la décomposition du peroxyde d’hydrogène en produits chimiques moins nocifs, l’oxygène et l’eau. 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) inhibe la catalase en se liant spécifiquement et de façon covalente au centre actif de l’enzyme, l’inactivant^17,18,19. ATZ a été utilisé pour étudier les effets du stress oxydatif à la fois in vitro et in vivo par l’inhibition de la catalase^{20,21,22,23,24}. Le peroxidase de glutathion catalyse la réduction du peroxyde d’hydrogène par l’antioxydant, le glutathion, et est une enzyme importante qui protège la cellule contre le stress oxydatif^25. L’acide mercaptosuccinique (MSA) inhibe le peroxidase de glutathion en se liant au site actif de sélénocystéine de l’enzyme avec le thiol, l’activant^26. MSA a été utilisé pour étudier les effets du stress oxydatif in vitro et in vivo ainsi^{que 20,27,28}.

Ce nouveau modèle de blessures chroniques est un modèle puissant à étudier parce qu’il partage plusieurs des mêmes caractéristiques observées dans les plaies chroniques diabétiques humaines, y compris l’inflammation prolongée de l’OS accru et la formation naturelle de biofilm du microbiome de peau. Les blessures ont altéré l’interaction dermale-épidermique, le dépôt anormal de matrice, l’angiogenèse pauvre et la vascularisation endommagée. Les blessures chroniques se développeront chez les souris mâles et femelles, de sorte que les deux sexes peuvent être utilisés pour étudier les plaies chroniques. Par conséquent, le modèle de blessure chronique peut contribuer de manière significative à faire progresser la compréhension fondamentale de la façon dont ces blessures commencent. L’utilisation de ce modèle de plaie chronique peut fournir des réponses à des questions fondamentales sur la façon dont la chronicité est initiée/réalisée grâce à des contributions de la physiologie de la cicatrisation des plaies altérées et du microbiome de l’hôte.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la réglementation fédérale et les politiques et procédures de l’Université de Californie ont été approuvées par l’Université de Californie, Riverside IACUC. 1. Animaux Utilisez le b6 diabétique et obèse. BKS(D)-Leprdb/J souris pour le modèle de blessure chronique. Les options d’achat comprennent soit des hétérozygotes pour la reproduction, soit des homozygotes directement pour des expéri…

Representative Results

La figure 5 illustre un exemple de blessure sans traitement d’inhibiteurs progressant vers la fermeture de la plaie et une plaie avec le traitement des inhibiteurs progressant vers la chronicité. Le pansement transparent a été laissé en place sur la plaie chronique afin que le biofilm et l’accumulation de liquide puissent être vus. L’initiation chronique de blessure a lieu en moins de 6 heures …

Discussion

Une fois que les blessures chroniques sont créées sur les souris, le modèle peut être utilisé pour étudier les processus de cicatrisation des plaies altérées impliqués dans l’initiation de la chronicité. Le modèle peut également être utilisé pour tester l’efficacité d’un large éventail de produits chimiques et de médicaments qui peuvent inverser le développement des plaies chroniques et une altération de la guérison et conduire à la fermeture des plaies et la guérison. Différents moments après l’d…

Materials

B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers