Protokoll for å skape kroniske sår i diabetiker mus

Summary

Kroniske sår er utviklet fra akutte sår på en diabetiker musemodell ved å indusere høye nivåer av oksidativt stress etter en full-tykkelse hud såret. Såret er behandlet med hemmere for catalase og glutation peroksidase, noe som resulterer i nedsatt healing og biofilm utvikling av bakterier tilstede i huden mikrobiomet.

Abstract

Kroniske sår utvikles som følge av defekt regulering i en eller flere komplekse cellulære og molekylære prosesser som er involvert i riktig helbredelse. De påvirker ~ 6,5 M mennesker og koster ~ $40B/Year i USA alene. Selv om en betydelig innsats har blitt investert i å forstå hvordan kroniske sår utvikles hos mennesker, forblir fundamentale spørsmål ubesvart. Nylig har vi utviklet en roman mus modell for diabetiker kroniske sår som har mange egenskaper av menneskelige kroniske sår. Ved hjelp av DB/DB^-/- mus, kan vi generere kroniske sår ved å indusere høye nivåer av oksidativt stress (OS) i sår vevet umiddelbart etter såret, ved hjelp av en en gangs behandling med hemmere som er spesifikke for antioksidant enzymer catalase og glutation peroksidase. Disse sårene har høye nivåer av OS, utvikle biofilm naturlig, bli fullt kronisk innen 20 dager etter behandling og kan forbli åpen mer i mer enn 60 dager. Denne romanen modellen har mange funksjoner av diabetiker kroniske sår hos mennesker og derfor kan bidra betydelig til å fremme grunnleggende forståelse av hvordan sårene blir kroniske. Dette er et stort gjennombrudd fordi kroniske sår hos mennesker forårsaker betydelig smerte og nød til pasienter og føre til amputasjon hvis uløst. Videre disse sårene er svært kostbart og tidkrevende å behandle, og føre til betydelig tap av personlig inntekt til pasienter. Fremskritt i dette feltet av studien gjennom bruk av våre kroniske sår modellen kan betydelig bedre helsetjenester for millioner som lider under denne ødeleggende tilstand. I denne protokollen, beskriver vi i stor detalj prosedyren for å forårsake akutte sår å bli kronisk, som ikke har blitt gjort før.

Introduction

Sår helbredelse innebærer komplekse cellulære og molekylære prosesser som er timelig og romlig regulert, organisert i sekvensiell og overlappende stadier som involverer mange forskjellige celletyper, inkludert men ikke begrenset til immunresponsen og den vaskulære system¹. Umiddelbart etter at huden opprettholder en skade, faktorer og blodceller samlet til såret området og starte den blødnings Cascade å danne en blodpropp. Etter homeostase oppnås, blodkarene dilate å slippe inn i såret området oksygen, næringsstoffer, enzymer, antistoffer og chemotactic faktorer som chemoattract polymorphonucleocytes å fjerne såret seng av fremmede rusk og skiller proteolytiske enzymer ². aktiverte blodplater skiller ut en rekke vekstfaktorer for å stimulere keratinocytter ved sårkanten for å re-epithelialize det sårede området. Monocytter rekruttert til såret stedet differensiere til makrofager som fagocyttere bakterier og døde nøytrofile og skiller flere faktorer for å opprettholde Keratinocyte proliferativ og Pro-trekk signaler. I sprednings fasen, mens re-epithelialization fortsetter, ny granulering vev sammensatt av fibroblaster, monocytter/makrofager, lymfocytter, og endothelial celler fortsette gjenoppbyggingen prosessen². Angiogenese stimuleres ved å fremme endothelial celle spredning og migrasjon, noe som resulterer i ny fartøy utvikling. Epithelialization og ombygging av ekstracellulære matrise konstruere en barriere mot miljøet. Som såret helbreder og granulering vev utvikler seg til et arr, apoptose eliminerer inflammatoriske celler, fibroblaster, og endothelial celler uten å forårsake ytterligere vevsskade. Strekk styrken av vevet forsterkes av fibroblaster remodeling ulike komponenter av ekstracellulære matrise, som kollagen, slik at den nyopprettede vevet er nesten like sterk og fleksibel som unwounded hud².

Eventuelle avvik fra denne svært samordnet progresjon mot sår lukking fører til nedsatt og/eller kroniske sår³. Kroniske sår er karakterisert ved økt oksidativt stress, kronisk betennelse, skadet microvasculature, og unormal kollagen matrise i såret⁴. Oksidativt stress, spesielt i såret, kan forsinke sår lukking^2,5. Når, i den første fasen av såret healing, den inflammatoriske fase blir uregulert, forutsetter verten vev omfattende skader på grunn av en kontinuerlig tilstrømning av inflammatoriske celler⁵ som slipper cytotoksisk enzymer, en økning i frie oksygen radikaler, og uregulert inflammatoriske meglere, noe som resulterer i celle død^6,7.

I denne destruktive mikromiljøet, biofilm-forming bakterier dra nytte av vert næringsstoffer og bidra til skaden av verten tissue². Disse biofilm er vanskelige å kontrollere og fjerne fordi hydrert ekstracellulære polymer stoffer bestående av proteiner, DNA, RNA, og polysakkarider gjør at bakterier næret innen å være tolerant for konvensjonell antibiotika behandling og unngå vertens medfødte og adaptive immunrespons^2,8,9.

Studere kroniske sår er avgjørende fordi de påvirker ~ 6 500 000 mennesker og koster ~ $40 000 000 000 per år i USA alene¹⁰. Pasienter med diabetes har økt risiko for å utvikle kroniske sår som krever amputasjon for å inneholde spredning av smitte. Disse pasientene har en 50% dødelighet risiko innen 5 år av amputasjon som er tilskrevet den patofysiologi mekanismen for diabetes¹¹. Forholdet mellom vertens immunsystem og mikrobiomet i såret healing er et viktig tema for pågående forskning fordi konsekvensene av kroniske sår, hvis uløst, inkluderer amputasjon og død¹².

Selv om en betydelig innsats har vært investert i å forstå hvordan kroniske sår utvikle seg hos mennesker, er det fortsatt uklart hvordan og hvorfor kroniske sår form. Eksperimenter for å studere mekanismer for nedsatt helbredelse er vanskelig å utføre i mennesker, og sår healing spesialister bare se pasienter med kroniske sår som allerede har nådd kronisitet i uker til måneder. Dermed spesialister er ikke i stand til å studere hvilke prosesser gikk galt som fører til at såret til å utvikle seg til å bli kronisk². Det er en mangel på dyremodeller som recapitulate kompleksiteten av menneskelige kroniske sår. Inntil vår modell ble utviklet, fantes ingen modell for kroniske sår studier.

Den kroniske sår modellen ble utviklet i mus som har en mutasjon i leptin reseptor (DB/DB^-/-)¹³. Disse musene er overvektige, diabetiker, og har nedsatt helbredelse, men ikke utvikle kroniske sår¹⁴. Blodsukkernivået gjennomsnittlig rundt 200 mg/dL, men kan være så høyt som 400 mg/dL¹⁵. Når høye nivåer av oksidativt stress (OS) i sår vevet blir indusert umiddelbart etter såret, blir såret kronisk¹⁶. DB/DB^-/- sår anses kronisk av 20 dager og forblir åpen for 60 dager eller mer. Biofilm produsert av bakterier kan sees utvikle begynnelsen tre dager etter såret; en moden biofilm kan sees 20 dager etter såret og vedvarer til enten såret nedleggelse. Den biofilm bakterier vi finner i disse musene er også funnet i Human diabetiker kroniske sår.

Oksidativt stress er indusert ved å behandle sårene med to hemmere av antioksidant enzymer, catalase og glutation peroksidase, to enzymer med kapasitet til å bryte ned hydrogen peroxide. Hydrogenperoksid er en reaktiv oksygen arter og kan forårsake cellulær skade gjennom oksidasjon av proteiner, lipider og DNA. Catalase katalyserer nedbryting av hydrogen peroxide i mindre skadelige kjemikalier oksygen og vann. 3-amino-1, 2, 4-for (ATZ) hemmer catalase ved binding spesielt og covalently til det aktive sentrum av enzymet, inaktivere det^17,18,19. ATZ har blitt brukt til å studere virkningene av oksidativt stress både in vitro og in vivo gjennom hemming av catalase^{20,21,22,23,24}. Glutation peroksidase katalyserer reduksjon av hydrogen peroxide gjennom antioksidant, glutation, og er et viktig enzym som beskytter cellen mot oksidativt stress²⁵. Mercaptosuccinic acid (MSA) hemmer glutation peroksidase ved binding til selenocysteine aktive området av enzymet med tiolderivat, inaktivere det²⁶. MSA har blitt brukt til å studere virkningene av oksidativt stress in vitro og in vivo samt^20,27,28.

Denne romanen modell av kroniske sår er en kraftig modell for å studere fordi den deler mange av de samme funksjonene observert i humant diabetiker kroniske sår, inkludert langvarig betennelse fra økt OS og naturlig biofilm dannelse fra huden mikrobiomet. Sårene har nedsatt dermal-epidermal interaksjon, unormal matrise deponering, dårlig angiogenese og skadet blodkar. Kroniske sår vil utvikle seg i både mannlige og kvinnelige mus, slik at begge kjønn kan brukes til å studere kroniske sår. Derfor kan den kroniske sår modellen bidra vesentlig for å fremme grunnleggende forståelse av hvordan slike sår begynner. Ved hjelp av denne kroniske sår modellen kan gi svar på grunnleggende spørsmål om hvordan kronisitet initieres/oppnås gjennom bidrag fra fysiologi av nedsatt sår helbredelse og mikrobiomet av verten.

Protocol

Alle eksperimenter ble gjennomført i samsvar og overholdelse av føderale forskrifter og University of California politikk og prosedyrer er godkjent av University of California, Riverside IACUC. 1. dyr Bruk diabetiker og obese B6. BKS (D)-LeprDB/J mus for kronisk såret modellen. Kjøpsalternativene omfatter enten heterozygotes for avl eller homozygoter direkte for eksperimenter. Breed heterozygot menn og kvinner til å produsere avkom. Bare en fjerdede…

Representative Results

Figur 5 viser et eksempel på et sår uten behandling av hemmere framover mot sår lukking og et sår med behandling av hemmere framover mot kronisitet. Den gjennomsiktige bandasjen har stått på plass på den kroniske såret slik at biofilm og væske akkumulering kan sees. Kronisk sår initiering finner sted på mindre enn 6 timer og såret margin er synlig endret fra oksidativt stress. Histologis…

Discussion

Når kroniske sår er opprettet på mus, kan modellen brukes til å studere nedsatt sår healing prosesser involvert i initiering av kronisitet. Modellen kan også brukes til å teste effekten av et bredt spekter av kjemikalier og stoffer som kan reversere kroniske sår utvikling og nedsatt helbredelse og føre til sår lukking og helbredelse. Ulike tidspunkt etter utbruddet av kronisitet kan bli studert: eg, dager 1-5 etter såret for tidlig utbruddet av kronisitet og dager 20 og utover for full styrke kroniske…

Materials

B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers