Protokoll för att skapa kroniska sår hos diabetiska möss

Summary

Kroniska sår utvecklas från akuta sår på en diabetiker musmodell genom att inducera höga nivåer av oxidativ stress efter en full-tjocklek kutan sår. Såret behandlas med hämmare för katalas och glutationperoxidas, vilket resulterar i försämrad läkning och biofilm utveckling av bakterier som finns i huden microbiome.

Abstract

Kroniska sår utvecklas som ett resultat av bristfällig reglering i en eller flera komplexa cellulära och molekylära processer som är involverade i korrekt läkning. De påverkar ~ 6,5 miljoner människor och kostar ~ $40B/Year i USA ensam. Även om en betydande ansträngning har investerats i att förstå hur kroniska sår utvecklas hos människor förblir grundläggande frågor obesvarade. Nyligen utvecklade vi en ny musmodell för diabetiska kroniska sår som har många egenskaper hos mänskliga kroniska sår. Med hjälp av db/DB^-/- möss, kan vi generera kroniska sår genom att inducera höga halter av oxidativ stress (OS) i såret vävnaden omedelbart efter sårande, med en engångs behandling med hämmare som är specifika för antioxidant enzymer katalas och glutathionperoxidas. Dessa sår har höga nivåer av OS, utveckla biofilm naturligt, bli helt kronisk inom 20 dagar efter behandling och kan förbli öppen mer för mer än 60 dagar. Denna roman modell har många funktioner av diabetiska kroniska sår hos människor och därför kan bidra avsevärt till att främja grundläggande förståelse för hur sår blir kroniska. Detta är ett stort genombrott eftersom kroniska sår hos människor orsakar betydande smärta och ångest till patienter och resultera i amputation om olösta. Dessutom är dessa sår mycket dyra och tidskrävande att behandla, och leda till betydande förlust av personlig inkomst till patienter. Framsteg inom detta område av studier genom användning av vår kroniska sår modell kan avsevärt förbättra vården för miljoner som lider under detta handikappande tillstånd. I detta protokoll beskriver vi i detalj förfarandet för att orsaka akuta sår för att bli kroniska, vilket inte har gjorts tidigare.

Introduction

Sårläkning involverar komplexa cellulära och molekylära processer som är temporally och rumsligt reglerade, organiserade i sekventiella och överlappande stadier som involverar många olika celltyper, inklusive men inte begränsat till immunförsvaret och den vaskulära system¹. Omedelbart efter att huden upprätthåller en skada, faktorer och blodkroppar aggregera till såret platsen och initiera koagulationskaskaden för att bilda en propp. Efter homeostas uppnås, blodkärlen vidga att släppa in på såret platsen syre, näringsämnen, enzymer, antikroppar och kemotaktisk faktorer som chemoattract polymorfonukleocyter att rensa såret sängen av främmande skräp och utsöndrar proteolytiska enzymer ². aktiverade trombocyter utsöndrar en mängd tillväxtfaktorer för att stimulera keratinocyterna vid sårkanten för att åter epitelialisera det sårade området. Monocyter rekryteras till såret platsen differentieras till makrofager som fagocytos bakterier och döda neutrofiler och utsöndrar ytterligare faktorer för att upprätthålla keratinocyter proliferativa och Pro-flyttande signaler. I spridningen fas, medan re-epitelisering fortsätter, ny granulering vävnad består av fibroblaster, monocyter/makrofager, lymfocyter, och endotelceller fortsätta återuppbyggnadsprocessen². Angiogenes stimuleras genom att främja endotelcellproliferation och migration, vilket resulterar i ny fartygs utveckling. Epithelialization och Remodeling av den extracellulära matrisen konstruera en barriär mot miljön. När såret läker och granulering vävnad utvecklas till ett ärr, apoptos eliminerar inflammatoriska celler, fibroblaster, och endotelceller utan att orsaka ytterligare vävnadsskada. Den draghållfasthet av vävnaden förstärks av fibroblaster remodeling olika komponenter i den extracellulära matrisen, som kollagen, så att den nybildade vävnaden är nästan lika stark och flexibel som osårad hud².

Varje avvikelse från denna mycket samordnade progression mot sår stängning leder till nedsatt och/eller kroniska sår³. Kroniska sår kännetecknas av ökad oxidativ stress, kronisk inflammation, skadad mikrovaskulatur, och onormal kollagen matris i såret⁴. Oxidativ stress, särskilt i såret, kan fördröja sår stängning^2,5. När, i det första stadiet av sårläkning, den inflammatoriska fasen blir oreglerad, den mottagande vävnaden förutsätter omfattande skador på grund av en kontinuerlig tillströmning av inflammatoriska celler⁵ som frigör cytotoxiska enzymer, en ökning av fria syreradikaler, och oreglerade inflammatoriska mediatorer, vilket resulterar i celldöd^6,7.

I denna destruktiva mikromiljö, biofilmbildande bakterier dra nytta av värd näringsämnen och bidra till skadan av värd vävnad². Dessa biofilmer är svåra att kontrollera och ta bort eftersom de hydrerade extracellulära polymera ämnen som består av proteiner, DNA, RNA, och polysackarider gör bakterier hyste inom att vara tolerant mot konventionella antibiotika terapier och kringgå värdens medfödda och adaptiva immunsvar^2,8,9.

Studerar kroniska sår är avgörande eftersom de påverkar ~ 6 500 000 personer och kostnad ~ $40 000 000 000 per år i USA ensam¹⁰. Patienter med diabetes har ökade risker för att utveckla kroniska sår som kräver amputation för att innehålla smittspridning. Dessa patienter har en 50% dödlighet risk inom 5 år av amputation som tillskrivs patofysiologi mekanismen för diabetes¹¹. Förhållandet mellan värdens immunförsvar och mikrobiomen i sårläkning är ett viktigt ämne för pågående forskning eftersom konsekvenserna av kroniska sår, om olösta, inkluderar amputation och död¹².

Även om en betydande ansträngning har investerats i att förstå hur kroniska sår utvecklas hos människor, är det fortfarande oklart hur och varför kroniska sår bildas. Experiment för att studera mekanismerna för nedsatt läkning är svårt att genomföra hos människor, och sårläkning specialister bara se patienter med kroniska sår som redan har nått kronicitet i veckor till månader. Sålunda, specialister är oförmögna att studera vilka processer gick fel som leder såret att utvecklas för att bli kronisk². Det finns en brist på djurmodeller som recapitulate komplexiteten av mänskliga kroniska sår. Tills vår modell utvecklades, ingen modell för kroniska sår studier existerade.

Den kroniska sårmodellen utvecklades hos möss som har en mutation i Leptin-receptorn (db/DB^-/-)¹³. Dessa möss är feta, diabetiker, och har nedsatt läkning men inte utveckla kroniska sår¹⁴. Blodglukosnivåer genomsnitt runt 200 mg/dL, men kan vara så hög som 400 mg/dL¹⁵. När höga halter av oxidativ stress (OS) i såret vävnaden induceras omedelbart efter sårande, blir såret kronisk¹⁶. Db/DB^-/- sår anses kroniska av 20 dagar och förbli öppen för 60 dagar eller mer. Biofilm produceras av bakterier kan ses utveckla början tre dagar efter att ha skadade; en mogen biofilm kan ses 20 dagar efter sårande och kvarstår tills antingen sår stängning. De biofilmbildande bakterier vi hittar i dessa möss finns också i mänskliga diabetiska kroniska sår.

Oxidativ stress induceras genom att behandla såren med två hämmare av antioxidant enzymer, katalas och glutationperoxidas, två enzymer med kapacitet att bryta ner väteperoxid. Väteperoxid är en reaktiv syreradikaler och kan orsaka cellulära skador genom oxidation av proteiner, lipider, och DNA. Katalas katalyserar nedbrytningen av väteperoxid i mindre skadliga kemikalier syre och vatten. 3-amino-1, 2, 4-triazol (ATZ) hämmar katalas vid bindning specifikt och kovalent till aktivet centrerar av enzymet som inaktiverar det^17,18,19. ATZ har använts för att studera effekterna av oxidativ stress både in vitro och in vivo genom hämning av katalas^{20,21,22,23,24}. Glutathione peroxidas katalyserar minskningen av väteperoxid genom antioxidant, glutation, och är ett viktigt enzym som skyddar cellen mot oxidativ stress²⁵. Merkaptobärnstenssyra (MSA) hämmar glutationperoxidas genom bindning till selenocystein aktiva platsen för enzymet med tiol, inaktiverar det²⁶. MSA har använts för att studera effekterna av oxidativ stress in vitro och in vivo samt^20,27,28.

Denna roman modell av kroniska sår är en kraftfull modell för att studera eftersom den delar många av samma funktioner som observerats i mänskliga diabetiska kroniska sår, inklusive långvarig inflammation från ökad OS och naturliga biofilm bildas från huden microbiome. Såren har försämrad dermal-epidermal interaktion, onormal mat ris deposition, dålig angiogenes och skadad vasculature. Kroniska sår kommer att utvecklas i både manliga och kvinnliga möss, så båda könen kan användas för att studera kroniska sår. Därför kan den kroniska sårmodellen bidra avsevärt till att främja grundläggande förståelse för hur sådana sår börjar. Med hjälp av denna kroniska sår modell kan ge svar på grundläggande frågor om hur kronicitet initieras/uppnås genom bidrag från fysiologi nedsatt sårläkning och mikrobiomet av värden.

Protocol

Alla experiment har slutförts i enlighet med och efterlevnad av Federal lagstiftning och University of California policy och förfaranden har godkänts av University of California, Riverside IACUC. 1. djur Använd diabetiker och feta B6. BKS (D)-Leprdb/j möss för den kroniska sårmodellen. Köpoptioner inkluderar antingen heterozygoter för avel eller homozygoter direkt för experiment. Föder heterozygot hanar och honor för att producera avkomma. En…

Representative Results

Figur 5 visar ett exempel på ett sår utan behandling av inhibitorer som fortskrider mot sår stängning och ett sår med behandling av inhibitorer som går mot chronicitet. Det genomskinliga förbandet har lämnats kvar på det kroniska såret så att bio film och vätskeansamling kan ses. Kronisk sår initiering sker på mindre än 6 timmar och sår marginalen är synligt förändrad från oxidat…

Discussion

När kroniska sår skapas på möss, kan modellen användas för att studera försämrad sårläkning processer inblandade i inledningen av chronicity. Modellen kan också användas för att testa effekten av ett brett spektrum av kemikalier och läkemedel som kan vända kronisk sårutveckling och försämrad läkning och leda till sår stängning och läkning. Olika tidpunkter efter uppkomsten av kronicitet kan studeras: t. ex., dagar 1-5 efter sårande för tidig debut av kronicitet och dagar 20 och därefter …

Materials

B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers