Diyabetik Farelerde Kronik Yaralar Oluşturma Protokolü

Summary

Kronik yaralar, tam kalınlıkta kutanöz bir yaradan sonra yüksek düzeyde oksidatif stres emilerek diyabetik fare modelindeki akut yaralardan gelişir. Yara katalaz ve glutatyon peroksidaz inhibitörleri ile tedavi edilir, cilt mikrobiyom mevcut bakteriler tarafından bozulmuş iyileşme ve biyofilm gelişimi ile sonuçlanan.

Abstract

Kronik yaralar, uygun iyileşme ile ilgili bir veya daha fazla karmaşık hücresel ve moleküler süreçlerde kusurlu düzenleme sonucu gelişir. Onlar etkisi ~ 6.5M kişi ve maliyet ~ $ 40B / yıl SADECE ABD’de. Kronik yaraların insanlarda nasıl geliştiğini anlamak için önemli bir çaba harcanmış olsa da, temel sorular cevapsız kalmıştır. Son zamanlarda, insan kronik yaraların birçok özelliği olan diyabetik kronik yaralar için yeni bir fare modeli geliştirdi. Db/db^-/- farekullanarak, yaradan hemen sonra yara dokusunda yüksek düzeyde oksidatif stres (OS) üreterek, antioksidan enzimlere özgü inhibitörlerle tek seferlik bir tedavi yöntemi yle kronik yaralar oluşturabilir ve glutatyon peroksidaz. Bu yaralar işletim sistemi yüksek düzeyde, doğal olarak biyofilm geliştirmek, tedaviden sonra 20 gün içinde tamamen kronik hale ve 60 günden fazla açık kalabilir. Bu yeni model insanlarda diyabetik kronik yaraların birçok özelliği vardır ve bu nedenle önemli ölçüde yaraların kronik hale nasıl temel anlayış ilerleyen katkıda bulunabilir. Bu büyük bir atılımdır, çünkü insanlardaki kronik yaralar hastalara önemli ölçüde acı ve sıkıntı yatır ve çözülmemişse ampütasyona neden olur. Ayrıca, bu yaralar çok pahalı ve tedavi etmek için zaman alıcı, ve hastalara kişisel gelir önemli kaybına yol açar. Bizim kronik yara modeli nin kullanımı ile çalışmanın bu alanda gelişmeler önemli ölçüde bu zayıflatıcı durum altında muzdarip milyonlarca sağlık artırabilir. Bu protokolde, akut yaraların kronikleşmesine neden olan ve daha önce yapılmamış olan prosedürü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Introduction

Yara iyileşmesi, bağışıklık yanıtı ve vasküler dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok farklı hücre tipini içeren sıralı ve üst üste gelen evrelerde düzenlenmiş, zamansal ve mekansal olarak düzenlenmiş karmaşık hücresel ve moleküler süreçleri içerir. sistem¹. Hemen sonra cilt bir yaralanma sürdürür, faktörler ve kan hücreleri yara bölgesine agrega ve pıhtı oluşturmak için pıhtılaşma kaskad başlatın. Homeostazı sağlandıktan sonra, kan damarları yara bölgesine oksijen, besin, enzim, antikor ve kemotaktik faktörlere izin vermek için genişledi. ². Aktif trombositler yara kenarındaki keratinositleri uyarmak için çeşitli büyüme faktörleri salgılar ve yaralı bölgeyi yeniden epitelize eder. Yara bölgesine alınan monositler, fagositoz bakteri ve ölü nötrofillerin makrofajlar halinde ayırt edilmesi ve keratinosit proliferatif ve pro-migratory sinyalleri korumak için ek faktörler salgılar. Proliferasyon aşamasında, yeniden epitelizasyon devam ederken, fibroblastlar oluşan yeni granülasyon dokusu, monositler / makrofajlar, lenfositler, ve endotel hücreleri yeniden inşa süreci devam². Anjiyogenez endotel hücre çoğalması ve göç teşvik ederek uyarılır, yeni damar gelişimi ile sonuçlanan. Hücre dışı matrisin epitelizasyonu ve yeniden biçimlendirilmesi çevreye karşı bir bariyer oluşturur. Yara iyileşir ve granülasyon dokusu bir yara dönüşür gibi, apoptoz ek doku hasarına neden olmadan inflamatuar hücreleri ortadan kaldırır, fibroblastlar, ve endotel hücreleri. Dokunun çekme mukavemeti, kollajen gibi hücre dışı matriksin çeşitli bileşenlerini yeniden şekillendiren fibroblastlar tarafından geliştirilmiştir, böylece yeni oluşan doku neredeyse yaralanmamış^deri2 kadar güçlü ve esnektir.

Yara kapanmasına doğru bu son derece uyumlu ilerleme herhangi bir sapma bozulmuş ve / veya kronik yaralara yol açar³. Kronik yaralar artmış oksidatif stres, kronik inflamasyon, hasarlı mikrovaskületür ve yarada anormal kollajen matriks ile karakterizedir⁴. Oksidatif stres, özellikle yara, yara kapanması^{geciktirebilir 2,5}. Yara iyileşmesinin ilk aşamasında, inflamatuar faz düzensiz hale geldiğinde, konak doku sitotoksik enzimler, serbest oksijen radikalleri bir artış serbest bırakmak inflamatuar hücrelerin sürekli akını⁵ nedeniyle geniş hasar varsayar ve düzensiz inflamatuar mediatörler, hücre ölümü ile sonuçlanan^6,7.

Bu yıkıcı mikroortamda, biyofilm oluşturan bakteriler konak besinlerden yararlanır ve konak dokusunun hasarına katkıda bulunur^2. Bu biyofilmlerin kontrol edilmesi ve çıkarılması zordur, çünkü proteinler, DNA, RNA ve polisakkaritlerden oluşan sulu ekstrasellüler polimerik maddeler, içinde barındırılan bakterilerin konvansiyonel antibiyotik tedavilere karşı toleranslı olmasını ve konakçının doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtı^2,8,9.

Onlar etkisi ~ 6.5 milyon kişi ve maliyet çünkü kronik yaralar çalışma çok önemlidir ~ ABD’de yılda ~ 40 milyar dolar tek başına¹⁰. Diyabetli hastalar enfeksiyon yayılmasını kontrol altına almak için ampütasyon gerektiren kronik yaralar geliştirme riskleri artmıştır. Bu hastalar,^diyabetinpatofizyoloji mekanizmasına atfedilen amputasyondan sonraki 5 yıl içinde %50 mortalite riskine sahiptir. Kronik yaraların sonuçları, çözülmemiş ise, amputasyon ve ölüm¹²dahil çünkü konağın bağışıklık sistemi ve yara iyileşmesi mikrobiyom arasındaki ilişki devam eden araştırma hayati bir konudur.

Kronik yaraların insanlarda nasıl geliştiğini anlamak için önemli bir çaba harcanmış olsa da, kronik yaraların nasıl ve neden oluştuğu hala belirsizdir. Bozulmuş iyileşme mekanizmalarını incelemek için deneyler insanlarda yapmak zordur, ve yara iyileşme uzmanları sadece zaten haftalarca aylarca kronikliğe ulaşmış kronik yaraları olan hastalar bakın. Böylece, uzmanlar kronik²haline gelişmeye yara yol hangi süreçlerin yanlış gitti çalışma yapamıyoruz. İnsan kronik yaralarının karmaşıklığını özetleyen hayvan modellerinin eksikliği vardır. Modelimiz geliştirilene kadar kronik yara çalışmaları için bir model yoktu.

Kronik yara modeli leptin reseptörü mutasyonu olan farelerde geliştirilmiştir (db/db^-/-)¹³. Bu fareler obez, diyabetik, ve iyileşme bozukluğu var ama kronik yaralar geliştirmek yok¹⁴. Kan şekeri düzeyleri ortalama 200 mg/dL civarındadır, ancak 400 mg/dL^15’ekadar çıkabilir. Yara dokusunda yüksek oksidatif stres (OS) düzeyleri yaralandıktan hemen sonra indüklendiğinde, yara kronik^{olur 16}. DB/db^-/- yaralar 20 gün kronik olarak kabul edilir ve 60 gün veya daha fazla açık kalır. Bakteriler tarafından üretilen biyofilm, yaralanmadan üç gün sonra gelişirken görülebilir; olgun bir biyofilm yaralamadan 20 gün sonra görülebilir ve her iki yara kapanana kadar devam eder. Bu farelerde bulduğumuz biyofilm oluşturan bakteriler insan diyabetik kronik yaralarda da bulunur.

Oksidatif stres antioksidan enzimler, katalaz ve glutatyon peroksidaz, hidrojen peroksit yıkmak için kapasitesi ile iki enzimiki inhibitörleri ile yaraların tedavisinde indüklenir. Hidrojen peroksit reaktif bir oksijen türüdür ve proteinlerin, lipidlerin ve DNA’nın oksidasyonu yoluyla hücresel hasara neden olabilir. Katalaz daha az zararlı kimyasallar oksijen ve su içine hidrojen peroksit ayrışması katalizler. 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) özellikle ve kovalent enzimin aktif merkezine bağlanarak katalaz inhibe,^{inaktive 17,18,19}. ATZ katalaz inhibisyonu yoluyla hem in vitro ve in vivo oksidatif stresetkilerini incelemek için kullanılmıştır^{20,21,22,23,24}. Glutatyon peroksidaz antioksidan yoluyla hidrojen peroksit azaltılması katalizler, glutatyon, ve oksidatif strese karşı hücre koruyan önemli bir enzimdir²⁵. Merkaptosuçinksinik asit (MSA) tiyol ile enzimin selnosistein aktif bölgeye bağlanarak glutatyon peroksidaz inhibe,^{inaktive 26}. MSA in vitro ve in vivo oksidatif stresin etkilerini incelemek için de kullanılmıştır^20,27,28.

Kronik yaraların bu yeni modeli, insan diyabetik kronik yaralarda gözlenen aynı özelliklerin birçoğunu paylaştığı için, artmış işletim sistemi ve cilt mikrobiyomlarından kaynaklanan doğal biyofilm oluşumundan kaynaklanan uzun süreli inflamasyon da dahil olmak üzere, çalışmak için güçlü bir modeldir. Yaralardermal-epidermal etkileşim, anormal matriks birikimi, kötü anjiyogenez ve hasarlı vaskülatür bozulmuştur. Kronik yaralar hem erkek hem de dişi farelerde gelişecektir, bu nedenle her iki cins de kronik yaraları incelemek için kullanılabilir. Bu nedenle, kronik yara modeli bu tür yaraların nasıl başladığını temel anlayış ilerlemek için önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu kronik yara modelinin kullanılması, bozulmuş yara iyileşmesi nin fizyolojisi ve konağın mikrobiyomu sayesinde kronikliğin nasıl başlatılabildiği/elde edildiği ile ilgili temel sorulara yanıt verebilir.

Protocol

Tüm deneyler federal düzenlemelere uygun olarak tamamlanmıştır ve University of California politikası ve prosedürleri University of California, Riverside IACUC tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan Diyabetik ve obez B6 kullanın. Kronik yara modeli içinLeprdb/J fareler. Satın alma seçenekleri üreme için heterozigotlar veya doğrudan deneyler için homozigotlar içerir. Üreme heterozigot erkek ve dişiler yavru üretmek için. Çöp sadece …

Representative Results

Şekil 5, yara kapatmaya doğru ilerleyen inhibitörlerin tedavisi olmayan bir yara ve kronikliğe doğru ilerleyen inhibitörlerin tedavisi ile bir yara örneği dir. Biyofilm ve sıvı birikiminin görülebilmeleri için kronik yaranın üzerine şeffaf pansuman bırakılmıştır. Kronik yara inisiyasyonu en az 6 saat içinde gerçekleşir ve yara marjı oksidatif stresten gözle görülür şeki…

Discussion

Farelerde kronik yaralar oluşturulduktan sonra, model kronikliğin başlatılmasında rol oynayan bozulmuş yara iyileşme süreçlerini incelemek için kullanılabilir. Model aynı zamanda kronik yara gelişimi ve bozulmuş iyileşme tersine çevirebilir ve yara kapatma ve iyileşme yol kimyasalları ve ilaçların geniş bir yelpazede etkinliğini test etmek için kullanılabilir. Kronikliğin başlangıcından sonra farklı zaman noktaları incelenebilir: örneğin, gün 1-5 kroniklik erken başlangıçlı i…

Materials

B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers