עבודה זו מספקת שיטה הזיוף של פלטפורמות מבוססות-droplet microfluidic לבין היישום של microspheres לזיהוי עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. שיטת ננו-ספירה-PCR מאפשר לקבל חד גדילי DNA amplicons מבלי המפריד בין שני גדילי ה-DNA.
מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet מאפשרים ייצור אמין microspheres הומוגנית בערוץ microfluidic, מתן הגודל מבוקרת של המורפולוגיה של ננו-ספירה שהושג. ננו-ספירה copolymerized עם בדיקה acrydite-DNA היה מפוברק בהצלחה. ניתן להשתמש בשיטות שונות כגון PCR אסימטרי, עיכול אקסונוקלאז, בידוד על מצופים streptavidin beads מגנטי לסנתז DNA חד-גדילי (ssDNA). עם זאת, שיטות אלה לא ניתן להשתמש ביעילות כמויות גדולות של ssDNA נקיים במיוחד. כאן, אנו מתארים ננו-ספירה-PCR פרוטוקול המפרט איך ssDNA יכול להיות ביעילות מוגבר, הופרדו dsDNA פשוט על-ידי pipetting של צינורית תגובת ה-PCR. ההגברה של ssDNA יכול להיות מיושם כמו ריאגנטים פוטנציאליים עבור DNA microarray ותהליכים (שיטתית האבולוציה של ליגנדים על ידי העשרת מעריכית) דנ א-SELEX.
דנ א חד גדילי (ssDNA) בהרחבה נחשב כרכיב הכרה מולקולרית (MRE) בשל תכונותיו מהותי עבור ה-DNA-DNA הכלאה1,2. פיתוח מערכות סינתטי ssDNA יכול להוביל יישומים ביולוגיים כגון ה-DNA מיקרו-מערכים3, oligotherapeutics, אבחון משולב חישה מולקולרי המבוסס על אינטראקציות משלימים4,5.
עד כה, חלקיקי הפולימר בקנה מידה מיקרומטר בהצלחה הוכחו באמצעות מכשירי microfluidic. מספר טכניקות microfluidic הוכחו להיות חזק להפקת microspheres מאוד הומוגנית על זרימה רציפה ב6,הסביבה microchannel7.
במחקר של Lee. et al. 8, פלטפורמה מבוססת-droplet microfluidic לסינתזה microfluidic של הגברה oligo-ננו-ספירה, ssDNA copolymerizable, דווח. פלטפורמת microfluidic מורכב שתי שכבות PDMS (polydimethylsiloxane): חלק עליון עם רשת ערוץ microfluidic ליצירת ננו-ספירה ו תחתון חלק שטוח. הבאנדש שלושה סוגים של ערוצי fluidic PDMS: 1) זרם התמקדות ערוץ לדור droplet 2) ערוץ סרפנטין לערבוב שני פתרונות, 3) ערוץ הפילמור רציפים התמצקות ננו-ספירה. לאחר שני זורם immiscible הם הציגו לתוך ערוץ fluidic PDMS אחד, שאפשר להכריח את הזורם דרך מבנה צר דיזה. ההתנהגויות זרימה כגון ערוץ גאומטריה, קצב הזרימה צמיגות להשפיע על הגודל ועל מורפולוגיה של ננו-ספירה. לכן, ניתן לחלק לזרם המרכזי נוזלי microscale monospheres9,10.
. הנה, ננו-ספירה מפורט-PCR פרוטוקול מסופק עבור ההגברה של ssDNA. ראשית, מתואר תהליך עיצוב של התקן מבוסס-droplet microfluidic. לאחר מכן, הדרך באילו לזיהוי microspheres יכול להיות functionalized עם תבנית ה-DNA אקראית באופן משלים הוא הסביר. לבסוף, מוצג עבור הגברה ssDNA פרוטוקול ננו-ספירה-PCR.
מזהמים של dsDNA הם נושא מרכזי ב- ssDNA הגברה. זה נשאר קשה למזער את dsDNA הגברה קונבנציונאלי אסימטרי PCR הגברה15. בנוסף, למרות שיפורים טכניים ליצירת ssDNA אפשרו לנו להגדיל את היעילות של תפוקה של הדוגמה, בידוד ssDNA הוא עדיין בעייתי בשל העלויות הגבוהות שלה טיהור לא שלם לקידומם.
PCR …
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי פרוייקט שכותרתו “קואופרטיב תכנית המחקר עבור חקלאות מדע & טכנולוגיה פיתוח (פרויקט מס ‘ PJ0011642) “ממומן על ידי המינהל לפיתוח כפרי, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה נתמכה גם בחלקו על ידי מענק (ה-NRF-2017R1A2B4012253) של התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן (ב- NRF) במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה גם נתמך על ידי מענק (N0000717) של התוכנית לחינוך עבור מדמין והתכנסות תעשייתי ממומן על ידי משרד המסחר, התעשייה, האנרגיה, הרפובליקה של קוריאה.
liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |