本工作为液滴基微流体平台的制备和聚丙烯酰胺微球在微球 pcr 扩增中的应用提供了一种方法。微球 pcr 方法可以在不分离双链 dna 的情况下获得单链 dna 扩增器。
液滴基微流体能够在微流体通道中可靠地生产均匀的微球, 从而提供所获得的微球的控制大小和形态。成功地制备了一种与丙烯酸-dna 探针共聚的微球。不同的方法, 如不对称 pcr, 外切酶消化, 和隔离条纹包覆磁珠可以用来合成单链 dna (ssdna)。然而, 这些方法不能有效地使用大量高度纯化的 ssdna。在这里, 我们描述了一个微球 pcr 协议, 详细介绍了如何通过从 pcr 反应管中移液来有效地扩增和分离 ssdna。ssdna 的扩增可作为 dna 微阵列和 dna-selex (通过指数富集的配体系统演化) 过程的潜在试剂。
单链 dna (ssdna) 由于其 dna-dna 杂交 1,2 的固有特性, 被广泛认为是一种分子识别元素(mre)。ssdna 合成系统的发展可导致生物应用, 如 dna 微阵列3、寡糖学、诊断和基于互补相互作用4,5的综合分子传感。
迄今为止, 微尺度聚合物颗粒已成功地使用微流体器件进行了演示。在微通道环境6、7中, 几种微流体技术已被证明是在连续流动上产生高度均匀微球的强大技术。
在李等人的研究中.8、基于液滴的微流体平台, 用于共聚寡微球的微流体合成和 ssdna 扩增。微流体平台由两个 pdms (聚二甲基硅氧烷) 层组成: 一个上部具有用于产生微球的微流体通道网络和一个底部平面部分。其中包括三种 pdms 流体通道: 1) 用于液滴生成的流聚焦通道, 2) 混合两个溶液的蛇形通道, 以及 3) 用于微球凝固的连续聚合通道。一旦两个不混溶的流被引入到一个单一的 pdms 流体通道中, 这些流就可以通过狭窄的孔口结构来强制。通道几何形状、流速和粘度等流动行为影响微球的大小和形态。因此, 主流可分为微尺度单圈9、10.
本文提供了一种详细的微球 pcr 扩增方法。首先, 介绍了一种基于液滴的微流体器件的设计过程。然后, 阐述了用随机 dna 模板互补化聚丙烯酰胺微球的方法。最后, 给出了一种扩增 ssdna 的微球 pcr 协议。
dsdna 的污染物是 ssdna 扩增中的一个主要问题。在传统的不对称 pcr 扩增中, 仍然很难将 dsdna 扩增降至最低。此外, 尽管生成 ssdna 的技术改进使我们能够提高样品吞吐量的效率, 但由于其成本高、纯化产量不完整, ssdna 分离仍然存在问题。
不对称 pcr 是处理 ssdna 时最具挑战性的方法之一。这种方法应用不等数量的引物 (例如, 20:1 比率), 以产生大量的 ssdna?…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了题为 “农业科技发展合作研究方案” 的项目 (项目号) 的支持。pj0011642) “由大韩民国农村发展管理局提供资金。这项研究还得到了大韩民国科学、信息和通信技术和未来规划部资助的基础科学研究方案赠款 (nrf-2017ra2b4012253) 的部分支持。这项研究还得到了大韩民国贸易、工业和能源部资助的创意和工业融合教育方案赠款 (n0000717) 的支持。
liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |