Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded
Summary
Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l’applicazione di microsfere di poliacrilammide per l’amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.
Abstract
Basato su goccia microfluidica consentono la produzione affidabile di microsfere omogenee nel canale di microfluidica, fornendo controllata, dimensioni e morfologia delle microsfere ottenute. Una microsfera copolimerizzato con una sonda di DNA coprocoltura con successo è stato fabbricato. Diversi metodi quali la PCR asimmetrica, digestione esonucleasi e isolamento su biglie magnetiche rivestite con streptavidina possono essere utilizzati per sintetizzare DNA a singola elica (ssDNA). Tuttavia, questi metodi non possono utilizzare in modo efficiente grandi quantità di altamente purificato ssDNA. Qui, descriviamo un protocollo di PCR di microsfere dettagliare come ssDNA può essere amplificato in modo efficiente e separato da dsDNA semplicemente pipettando da una provetta di reazione di PCR. L’amplificazione di ssDNA può essere applicato come potenziali reagenti per i microarray del DNA e DNA-SELEX (sistematica evoluzione di ligandi di arricchimento esponenziale) processi.
Introduction
DNA a singola elica (ssDNA) è stato ampiamente considerato come un elemento di riconoscimento molecolare (MRE) grazie alle sue proprietà intrinseche per l’ibridazione DNA-DNA1,2. Lo sviluppo di sistemi sintetici ssDNA può portare ad applicazioni biologiche quali DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostica e molecolare di rilevamento integrato basato su interazioni complementari4,5.
Fin qui, le particelle di polimero di scala micrometrica sono state dimostrate con successo utilizzando dispositivi microfluidici. Diverse tecniche di microfluidica hanno dimostrati di essere potente per la produzione di microsfere altamente omogenee il flusso continuo in ambiente microchannel6,7.
Nello studio di Lee et al. 8, una piattaforma di microfluidica gocciolina-basato per la sintesi di microfluidica di amplificazione oligo-microsfere e ssDNA qui è stato segnalato. La piattaforma microfluidica è costituito da due strati PDMS (polidimetilsilossano): una parte superiore con una rete di canali microfluidici per la generazione di microsfere e un fondo piatto a parte. Questi consistono di tre tipi di canali fluidici PDMS: 1) un flusso di canale per la generazione di goccia, 2) un canale serpeggiante per la miscelazione di due soluzioni e 3) un canale di polimerizzazione sequenziale per solidificazione di microsfere di messa a fuoco. Una volta due flussi immiscibili vengono introdotti in un singolo canale fluidico PDMS, i flussi possono essere forzati attraverso la struttura di orifizio stretto. I comportamenti di flusso come geometria del canale, portata e viscosità influiscono sulla dimensione e la morfologia delle microsfere. Pertanto, il principale flusso di liquido può essere diviso in Microscala monospheres9,10.
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato microsfera-PCR per l’amplificazione di ssDNA. In primo luogo, un processo di progettazione di dispositivi microfluidici basati su goccia è descritto. Quindi, è spiegato il modo in cui poliacrilammide microsfere possono essere funzionalizzate con modello casuale di DNA in maniera complementare. Infine, un protocollo di microsfere-PCR per amplificare ssDNA è mostrato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contaminanti di dsDNA sono un problema importante in ssDNA amplificazione. Rimane difficile minimizzare dsDNA amplificazione in convenzionale di amplificazione in PCR asimmetrica15. Inoltre, anche se miglioramenti tecnici per la generazione di ssDNA hanno permesso di aumentare l’efficienza di rendimento del campione, ssDNA isolamento è ancora problematico a causa di suoi alti costi e rendimenti di depurazione incompleta.
PCR asimmetrica è uno dei più impegnativi meto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è supportato da un progetto intitolato “programma di ricerca cooperativa per agricoltura Science & Technology Development (progetto n ° PJ0011642) “finanziato dal governo di sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata sostenuta in parte anche da una sovvenzione (NRF-2017R1A2B4012253) del programma di ricerca scienza base attraverso la Fondazione di ricerca nazionale (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata anche sostenuta da una sovvenzione (N0000717) del programma di educazione per creativi e convergenza industriale finanziato dal Ministero del commercio, industria ed energia, Repubblica di Corea.
Materials
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
Riferimenti
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