Подход, основанный на капельки Microfluidic и микросферы ПЦР-амплификации для одноцепочечной ДНК ампликонов
Summary
Эта работа предоставляет метод для изготовления на основе капелька microfluidic платформ и применение полиакриламида микросферы для микросфер ПЦР-амплификации. Микросфера PCR метод делает возможным получить одноцепочечной ДНК ампликонов без разделения двуцепочечной ДНК.
Abstract
На основе капелька микрофлюидика возможность надежного производства однородных микросфер в канале microfluidic, предоставляя контролируемый размер и морфология полученные микросфер. Микросфера Сополимеризованная с acrydite ДНК-зонд был успешно сфабрикованы. Различные методы, такие как асимметричное PCR, при exonuclease пищеварение и изоляции на стрептавидина покрытием магнитные бусы может использоваться для синтеза ДНК одноцепочечной (ssDNA). Однако эти методы не могут эффективно использовать большие объемы высокоочищенных ssDNA. Здесь мы описываем микросферы ПЦР протокола, детализируя как ssDNA можно эффективно усиливается и отделены от dsDNA просто дозирование из трубки реакции PCR. Амплификация ssDNA может применяться как потенциальные реагенты для microarray ДНК и ДНК-SELEX (систематической эволюции лигандов на экспоненциальное обогащения) процессов.
Introduction
Одноцепочечной ДНК (ssDNA) широко рассматривается как элемент молекулярного распознавания (MRE) из-за его внутренние свойства для ДНК-ДНК гибридизации1,2. Разработка ssDNA синтетических систем может привести к биологических приложений, таких как ДНК microarrays3, oligotherapeutics, диагностика и комплексной молекулярной зондирования на основе взаимодополняющих взаимодействия4,5.
На сегодняшний день, Микрометр шкала полимерные частицы были успешно продемонстрированы используя microfluidic приборы. Несколько методов microfluidic доказали быть мощным для производства весьма однородной микросфер на непрерывный поток в микроканальные среды6,7.
В исследовании Lee et al. 8, на основе капелька microfluidic платформа для microfluidic синтеза copolymerizable oligo микросферы и ssDNA амплификации было сообщено. Microfluidic платформа состоит из двух слоев PDMS (полидиметилсилоксан): Верхняя часть с microfluidic канала сети для генерации микросфер и дно плоской части. Они состоят из трех видов PDMS аэрогидродинамических каналов: 1) поток канал для поколения капелька, 2) серпантином канал для смешивания двух решений и 3) последовательных полимеризации канал для микросфер затвердевания. После того, как в один канал аэрогидродинамических PDMS вводятся две Несмешивающиеся потоков, потоков может быть принужден через узкие отверстия структуру. Потока поведения, таких как канал геометрии, скорость потока и вязкость влияет на размер и морфология микросфер. Таким образом основной поток жидкости можно подразделить микромасштабной monospheres9,10.
Здесь подробные микросферы ПЦР протокола предоставляется для амплификации ssDNA. Во-первых описан процесс проектирования устройств на базе капелька microfluidic. Затем объясняется способ, в котором полиакриламида микросферы можно функционализированных с случайных ДНК шаблон на взаимодополняющей основе. Наконец показана микросферы ПЦР протокола для усиления ssDNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Загрязнители dsDNA являются серьезной проблемой в ssDNA амплификации. Он по-прежнему трудно свести к минимуму dsDNA амплификации в обычных Асимметричное PCR амплификация15. Кроме того хотя технические усовершенствования для генерации ssDNA позволили нам увеличить эффективность обр?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддерживается проекта под названием «Совместная программа исследований для сельскохозяйственной науки и технологического развития (проект № PJ0011642) «финансируется администрацией сельского развития, Республика Корея. Это исследование было также частично при поддержке гранта (СР 2017R1A2B4012253) основной программы исследований науки через Национальный фонд исследований (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования, Республика Корея. Это исследование было также поддержано Грант (N0000717) программы образования для творческих и промышленные конвергенции, финансируемого министерством торговли, промышленности и энергетики, Республика Корея.
Materials
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
Riferimenti
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays. Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3′–>5′ exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
