Una gotita-enfoque basado en microfluidos y amplificación por PCR de microesfera para amplicones de ADN

Summary

Este trabajo proporciona un método para la fabricación de plataformas de microfluídica basada en la gota y la aplicación de microesferas de poliacrilamida para la amplificación por PCR de la microesfera. El método de microesfera-PCR hace posible obtener amplicones de ADN monocatenario sin la separación del ADN de doble hebra.

Abstract

Microfluídica basada en gotita permite la producción confiable de microesferas homogéneas en el canal microfluídico, controlado tamaño y morfología de la microesfera obtenida. Una microesfera copolymerized con una sonda de ADN acrydite se fabricó con éxito. Diferentes métodos como PCR, digestión de exonucleasa y aislamiento en bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina asimétrica pueden utilizarse para sintetizar ADN monocatenario (ssDNA). Sin embargo, estos métodos no utilizan eficientemente grandes cantidades de ssDNA altamente purificado. Aquí, describimos un protocolo de PCR microesfera detallando cómo ssDNA puede ser eficientemente amplificado y separado de dsDNA simplemente transfiriendo de un tubo de reacción de PCR. La amplificación de ssDNA puede aplicarse como potencial reactivo de los microarrays de DNA y DNA-SELEX (evolución sistemática de los ligandos por el enriquecimiento exponencial) procesos.

Introduction

ADN monocatenario (ssDNA) ha sido ampliamente considerado como un elemento de reconocimiento molecular (MRE) debido a sus propiedades intrínsecas para hibridación de ADN-DNA^1,2. El desarrollo de sistemas sintéticos ssDNA puede conducir a aplicaciones biológicas como ADN microarrays³, oligotherapeutics, diagnóstico y detección molecular integrado basado en interacciones complementarias^4,5.

Hasta la fecha, las partículas de polímero de micrómetro-escala han demostrado con éxito utilizando dispositivos microfluídicos. Varias técnicas de microfluidos han demostrado para ser potentes para la producción de microesferas muy homogéneas en un flujo continuo en el entorno de microchannel^6,7.

En el estudio de Lee et al. se informó de ⁸, una plataforma de microfluídica basada en gotas para la síntesis de microfluídica de amplificación microesfera de oligo y ssDNA copolymerizable. La plataforma de microfluidos consiste en dos capas PDMS (polidimetilsiloxano): una parte superior con una red de canal de microfluidos para la generación de la microesfera y un fondo plano parte. Éstos consisten en tres tipos de canales fluídicos PDMS: 1) un flujo enfoque canal para la generación de gotas, 2) un canal serpenteante para la mezcla de dos soluciones y 3) un canal de polimerización secuencial para la solidificación de la microesfera. Una vez que se introducen dos flujos inmiscibles en un solo canal fluídico de PDMS, los flujos pueden ser forzados a través de la estructura del orificio estrecho. Los comportamientos de flujo tales como la geometría del canal, caudal y la viscosidad afectan el tamaño y la morfología de la microesfera. Por lo tanto, la corriente líquida principal puede dividirse en microescala monospheres^9,10.

Aquí, se proporciona un protocolo detallado de microesfera-PCR para la amplificación de ssDNA. En primer lugar, se describe un proceso de diseño de dispositivos microfluídicos basada en gotas. A continuación, se explica la manera en que la poliacrilamida microesferas pueden ser funcionalizadas con plantilla de ADN al azar de manera complementaria. Por último, se muestra un protocolo de microesfera-PCR para amplificar ssDNA.

Protocol

1. fabricación de una plataforma de microfluídica PDMS Prepare 20 mL de líquido prepolímero PDMS mezclando polímero base y catalizador en una proporción de volumen de 10:1. Vierta 10 mL de líquido PDMS en un molde de SU-8 preparado sobre una oblea de silicio en la parte superior de la red de microfluidos. Para la parte plana del fondo, vierta el mismo volumen de líquido PDMS en la oblea de silicio sin estructura de molde.Nota: La red de microfluidos es diseñada en un programa CAD y luego se convier…

Representative Results

La plataforma fabricado microfluídicos poliméricos basados en la gota consiste en dos capas PDMS (Figura 1a). Se utilizan tres tipos de redes de canales de microfluidos para generar microesferas: geometría 1) el enfoque de flujo como se muestra en la Figura 1b, 2) un canal serpenteante para mezclar solución I solución II y 3) un canal de polimerización para microesfera solidificación. La altura de todos los canales fue 60 …

Discussion

Contaminantes de dsDNA son una cuestión importante en la amplificación de ssDNA. Sigue siendo difícil minimizar la amplificación de dsDNA de amplificación PCR asimétrico convencional¹⁵. Además, aunque mejoras técnicas para la generación de ssDNA nos han permitido aumentar la eficiencia de producción de muestras, aislamiento de ssDNA es todavía problemática debido a sus altos costos y rendimientos de depuración incompleta.

PCR asimétrico es uno de los méto…

Materials

liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres