Une approche fondée sur les gouttelettes de microfluidique et microsphères-PCR Amplification d’ADN monocaténaire Amplicons

Summary

Cet ouvrage fournit une méthode pour la fabrication de plateformes microfluidiques axée sur la goutte et l’application des microsphères de polyacrylamide pour l’amplification PCR-microsphères. La méthode PCR-microsphères permet d’obtenir des amplicons ADN monocaténaire sans séparer l’ADN bicaténaire.

Abstract

Axée sur les gouttelettes microfluidics permettent la production fiable des microsphères homogènes dans le canal de la microfluidique, fournissant contrôlé de taille et de la morphologie de la microsphère obtenu. Une microsphère copolymérisé avec une sonde d’ADN-acrydite a été fabriqué avec succès. Différentes méthodes telles que la PCR asymétrique, digestion exonucléase et l’isolation sur streptavidine des billes magnétiques permet de synthétiser l’ADN simple brin (ADN simple brin). Cependant, ces méthodes ne peut pas utiliser efficacement de grandes quantités d’ADN simple brin hautement purifiée. Nous décrivons ici un protocole de PCR-microsphères détaillant comment ADNsb peut être efficacement amplifié et séparé du dsDNA simplement par pipetage à partir d’un tube de réaction PCR. L’amplification de l’ADN simple brin peut être appliquée comme réactifs possibles pour les biopuces et ADN-SELEX (évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel).

Introduction

ADN simple brin (ssDNA) a été largement considéré comme un élément de reconnaissance moléculaire (MRE) en raison de ses propriétés intrinsèques d’hybridation de l’ADN^1,2. Le développement de systèmes synthétiques ADNsb peut conduire à des applications biologiques telles que l’ADN microarrays³, oligotherapeutics, diagnostic et détection moléculaire intégrée basée sur des interactions complémentaires^4,5.

A ce jour, les particules de polymère-l’échelle du micromètre ont fait leur preuve à l’aide de dispositifs microfluidiques. Plusieurs techniques de microfluidique sont est avérés pour être puissant pour produire des microsphères très homogènes sur le flux continu du microchannel environnement^6,7.

Dans l’étude de Lee et al. ⁸, une plate-forme microfluidique axée sur les gouttelettes de synthèse microfluidique de polymérisables oligo-microsphères et ADNsb amplification a été signalé. La plate-forme microfluidique se compose de deux couches PDMS (diméthylsiloxane) : une partie supérieure avec un réseau de canaux microfluidiques pour générer des microsphères et un fond plat partie. Ceux-ci se composent de trois types de canaux fluidiques PDMS : 1) un débit en se concentrant channel pour la production de gouttelettes, 2) une chaîne serpentine pour mélanger les deux solutions et 3) un canal de polymérisation séquentiel pour la solidification de microsphères. Une fois que les deux flux non miscibles sont introduits dans un seul canal fluidique de PDMS, le flux peut être forcé à travers la structure de l’orifice étroit. Les comportements de flux tels que la géométrie du canal, débit et viscosité affectent la taille et la morphologie de la microsphère. Par conséquent, le flux de liquid principal peut être divisé en microscale monospheres^9,10.

Ici, un protocole détaillé microsphères-PCR est fourni pour l’amplification de l’ADN simple brin. Tout d’abord, un processus de conception de dispositif microfluidique axée sur la gouttelette est décrite. Ensuite, la façon dans laquelle polyacrylamide microsphères peuvent être fonctionnalisés avec matrice aléatoire d’ADN de manière complémentaire est expliquée. Enfin, un protocole de microsphères-PCR pour amplifier l’ADN simple brin est montré.

Protocol

1. fabrication d’une plate-forme de microfluidique PDMS Préparer 20 mL de liquide prépolymère de PDMS en mélangeant à base de polymères et de catalyseur dans un rapport de volume de 10:1. Verser 10 mL du liquide PDMS sur un moule de SU-8 préparé sur une plaquette de silicium pour la partie supérieure du réseau microfluidique. Pour la partie inférieure plate, versez le même volume de liquide PDMS sur la plaquette de silicium sans une structure de moule.Note : Le réseau microfluidique est con?…

Representative Results

La plate-forme fabriqué polymériques axée sur les gouttelettes microfluidique se compose de deux couches PDMS (Figure 1 a). Trois types de réseaux de canaux microfluidiques sont utilisés pour générer des microsphères : géométrie 1) flux de mise au point comme illustré dans la Figure 1 bet 2) une chaîne serpentine pour mélanger la solution solution II et j’ai 3) un canal de polymérisation des microsphères solidif…

Discussion

Contaminants des ADN double brin sont un enjeu majeur pour l’amplification de l’ADN simple brin. Il reste difficile d’amplification ADN double brin dans les classiques de l’amplification PCR asymétrique¹⁵de minimiser. En outre, bien que des améliorations techniques pour générer des ADN simple brin nous ont permis d’accroître l’efficacité du débit de l’échantillon, isolement de l’ADN simple brin est toujours problématique en raison de ses coûts élevés et des rendements d…

Materials

liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres