CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum
Summary
Vi beskriver en metod för att skapa glmS-baserat villkorlig knockdown mutanter i Plasmodiumfalciparum använder CRISPR/Cas9 gen editering.
Abstract
Malaria är en betydande orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Denna sjukdom, som främst drabbar dem som lever i tropiska och subtropiska regioner, orsakas av infektion med Plasmodium parasiter. Utvecklingen av mer effektiva läkemedel för att bekämpa malaria kan påskyndas genom att förbättra vår förståelse av biologi av denna komplexa parasit. Genmanipulation av dessa parasiter är nyckeln till att förstå deras biologi; men har historiskt genomet hos P. falciparum varit svårt att manipulera. CRISPR/Cas9 gen editering har nyligen använts i malaria parasiterna, vilket möjliggör enklare protein taggning, generation av villkorlig protein knockdowns och radering av gener. CRISPR/Cas9 gen editering har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att främja malaria forskning. Här, vi beskriver en CRISPR/Cas9 metod för att skapa glmS-baserat villkorlig knockdown mutanter i P. falciparum. Denna metod är mycket anpassningsbar till andra typer av genetiska manipulationer, inklusive protein taggning och gen knockouts.
Introduction
Malaria är en förödande sjukdom orsakad av urdjursparasiter av släktet Plasmodium. P. falciparum, de flesta dödliga mänskliga malariaparasiten, orsakar cirka 445,000 dödsfall per år, mestadels i barn under fem1år. Plasmodium parasiter har en intrikat livscykel som innefattar en mygga vektor och en vertebrate värd. Människor smittas först när en infekterad mygga tar en blodmjöl. Parasiten invaderar sedan levern där den växer, utvecklas och delar för cirka en vecka. Efter denna process släpps parasiterna ut i blodomloppet, där de genomgår asexuell replikering i röda blodkroppar (RBC). Tillväxt av parasiter inom de röda blodkropparna är direkt ansvariga för kliniska symptom i samband med malaria2.
Tills nyligen var produktionen av transgena P. falciparum en mödosam process, som involverar flera omgångar av drogen urval som tog många månader och hade en hög felfrekvens. Detta tidsödande förfarande relieson bryter generering av slumpmässiga DNA i regionen av intresse och parasiten endogena förmåga att laga sin arvsmassa men homologa reparation3,4,5,6 . Nyligen, klustrade regelbundet mellanliggande Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) gen editering har framgångsrikt använts i P. falciparum7,8. Införandet av denna nya teknik i malaria forskning har varit avgörande för avancerad förståelse av biologi av dessa dödliga parasiter Plasmodium . CRISPR/Cas9 möjliggör specifik inriktning av gener genom guide RNAs (gRNAs) som är homolog till genen av intresse. Den gärna/Cas9 komplexa erkänner genen genom gärna och Cas9 sedan introducerar en dubbel-strand paus, tvingar inledandet av reparationsmekanismer i organismen9,10. Eftersom P. falciparum saknar maskinen för att reparera DNA pauser genom icke-homolog slutet att gå, det använder homolog rekombination mekanismer och integrerar transfekterade homologa DNA-mallar för att reparera det Cas9/gärna-inducerat dubbel-strand break11,12.
Här presenterar vi ett protokoll för generering av villkorlig knockdown mutanter i P. falciparum använder CRISPR/Cas9 gen editering. Protokollet visar användningen av de glmS ribozym till villkorligt knockdown proteinnivåer av PfHsp70x (PF3D7_0831700), ett förkläde exporteras av P. falciparum till värd röda blodkropparna13,14. Den glmS ribozym aktiveras genom behandling med glukosamin (som omvandlas till glukosamin-6-fosfat i celler) för att klyva dess associerade mRNA, leder till en minskning av protein14. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att utnyttja andra villkorsstyrda knockdown verktyg, såsom destabilisering domäner eller RNA aptamers4,5,15. Vår protokolldetaljer generering av en reparation plasmid bestående av en hemagglutinin (HA) tag och glmS ribozym kodande sekvens flankerad av sekvenser som är homolog till PfHsp70x öppen läsning ramen (ORF) och 3′-UTR. Vi beskriver också generationen av en andra plasmid att driva uttryck för gärna. Dessa två plasmider, tillsammans med en tredje som driver uttryck för Cas9, är transfekterade i röda blodkroppar och används för att ändra genomet hos P. falciparum parasiter. Slutligen beskriver vi ett polymeras-kedjereaktion (PCR)-baserad teknik för att kontrollera integrationen av den taggen och glmS Ribozym. Detta protokoll är mycket anpassningsbar till ändring eller komplett knockout av någon P. falciparum gener, förbättra vår förmåga att generera nya insikter i biologin av malariaparasiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genomförandet av CRISPR/Cas9 i P. falciparum har både ökad effektivitet och minskade mängden tid som behövs för att ändra parasitens arvsmassa, jämfört med tidigare metoder för genetisk manipulation. Denna omfattande protokoll beskriver stegen som krävs för att generera villkorlig mutanter med CRISPR/Cas9 i P. falciparum. Medan metoden här är inriktade specifikt för generering av HA –glmS mutanter, kan denna strategi anpassas för en mängd behov, inklusive märkning av gener, ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Muthugapatti Kandasamy vid University of Georgia (UGA) biomedicinska mikroskopi kärnan för tekniskt bistånd och Jose-Juan Lopez-Rubio för att dela de pUF1-Cas9 och pL6 plasmidsna. Detta arbete stöds av bågar Foundation utmärkelser till D.W.C. och H.M.K., UGA start medel till V.M., bidrag från mars av Dimes Foundation (basilika O’Connor Starter Scholar Research Award) till V.M. och oss National Institutes of Health beviljar (R00AI099156 och R01AI130139) till V.M. och (T32AI060546) till H.M.K.
Materials
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
