CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in Plasmodium Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden.
Abstract
Malaria ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität weltweit. Diese Krankheit, die vor allem in tropischen und subtropischen Regionen lebenden Menschen beeinflusst, verursacht durch Infektion mit Plasmodium -Parasiten. Die Entwicklung wirksamer Medikamente zur Bekämpfung der Malaria kann durch ein besseres Verständnis der Biologie dieser komplexen Parasiten beschleunigt werden. Genetische Manipulation dieser Parasiten ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer Biologie; Allerdings ist historisch das Genom von p. Falciparum schwierig zu handhaben gewesen. Vor kurzem wurde CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung im Malaria-Parasiten, zulassend einfacher Protein tagging, Erzeugung von bedingten Protein Niederschlägen und Löschung von Genen genutzt. CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung erweist sich ein mächtiges Werkzeug für die Förderung der Malaria-Forschung. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9 Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in p. Falciparum. Diese Methode ist sehr anpassungsfähig an andere Arten von genetischen Manipulationen, einschließlich Protein-tagging und gen Knockouts.
Introduction
Malaria ist eine verheerende Krankheit verursacht durch Protozoen Parasiten der Gattung Plasmodium. P. Falciparum, der meisten tödlichen menschlichen Malaria-Parasiten verursacht rund 445.000 Todesfälle pro Jahr, meist bei Kindern unter dem Alter von fünf1. Plasmodium -Parasiten haben einen komplizierten Lebenszyklus mit einem Moskito Vektor und ein Wirbeltier Host. Menschen infizieren sich zunächst eine infizierte Mücke eine Blutmahlzeit nimmt. Dann der Parasit dringt in die Leber, wo es wächst, entwickelt sich und teilt für etwa eine Woche. Nach diesem Vorgang sind die Parasiten in den Blutkreislauf freigesetzt, wo sie asexuelle Reproduktion in roten Blutkörperchen (Erythrozyten) unterzogen werden. Wachstum des Parasiten innerhalb der Erythrozyten sind direkt verantwortlich für die klinischen Symptome im Zusammenhang mit Malaria-2.
Bis vor kurzem war die Herstellung von transgenen p. Falciparum ein langwieriger Prozess, an denen mehrere Runden der Droge-Auswahl, das dauerte viele Monate und hatte eine hohe Ausfallrate. Diese zeitraubende Prozedur Relieson bricht die Generierung von zufälligen DNA in der Region von Interesse und die endogene Fähigkeit des Parasiten zu Flicken sein Genom aber Homologen Reparatur3,4,5,6 . Vor kurzem hat die gruppierten regelmäßig dazwischen palindromische Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) Genom-Bearbeitung erfolgreich in p. Falciparum7,8verwendet worden. Die Einführung dieser neuen Technologie in der Malaria-Forschung hat für die Förderung von Verständnis für die Biologie dieser tödlichen Parasiten Plasmodium kritisiert. CRISPR/Cas9 ermöglicht eine spezifische Ausrichtung der Gene durch Guide RNAs (gRNAs), die Homolog zu gen von Interesse sind. Die gRNA/Cas9-Komplex erkennt das Gen durch die gRNA und Cas9 führt dann eine Doppel-Strang Pause zwingen die Einleitung von Reparaturmechanismen in den Organismus9,10. Da p. Falciparum Maschinen zur Reparatur von DNA-Brüchen durch nicht-homologe Ende Beitritt fehlt, es homologe Rekombination Mechanismen nutzt und integriert transfizierten homologe DNA-Templates um die Cas9/gRNA-induzierte reparieren Doppel-Strang Pause11,12.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Generation der bedingten Knockdown Mutanten in p. Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden. Das Protokoll veranschaulicht Verwendung der quantifizierten Ribozym, bedingt Knockdown proteingehalte der PfHsp70x (PF3D7_0831700), ein Chaperon exportiert durch p. Falciparum in Host RBCs13,14. Die quantifizierten Ribozym wird durch Behandlung mit Glucosamin (die zu Glucosamin-6-Phosphat in den Zellen umgewandelt wird) um seine zugehörige mRNA, führt zu einem Rückgang der Protein-14Spalten aktiviert. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere bedingte Knockdown Tools, z. B. Destabilisierung Domänen oder RNA aptameren4,5,15nutzen zu können. Unsere Protokolldetails sind die Generation der ein Reparatur-Plasmid, bestehend aus einem Hämagglutinin (HA) Tag und quantifizierten Ribozym Codierung Sequenz flankiert von Sequenzen, die Homolog zu PfHsp70x offenen Leserahmen (ORF) und 3′-UTR. Wir beschreiben auch die Generation der zweite Plasmid zu Laufwerk Ausdruck der gRNA. Diese zwei Plasmide, zusammen mit einem Dritten, der Ausdruck der Cas9, treibt in Erythrozyten transfiziert und verwendet, um das Genom von p. Falciparum Parasiten ändern. Schließlich beschreiben wir eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Technik, um die Integration der Tags und quantifizierten Ribozym überprüfen. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig für die Änderung oder die komplette ko von keine p. Falciparum Gene, Verbesserung unserer Fähigkeit, neue Einblicke in die Biologie des Malaria-Parasiten zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Umsetzung der CRISPR/Cas9 in p. Falciparum hat sowohl erhöht die Effizienz und verringert den Zeitaufwand für die Änderung der Parasit Genom, im Vergleich zu bisherigen Methoden der genetischen Manipulation. Dieses umfassende Protokoll beschreibt die Schritte, die notwendig für die Erzeugung von bedingten Mutanten mit CRISPR/Cas9 in p. Falciparum. Während die Methode hier speziell für die Generation von HA –quantifizierten Mutanten ausgerichtet ist, kann diese Strategie für eine Viel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Muthugapatti Kandasamy Herzstück der University of Georgia (UGA) biomedizinischen Mikroskopie für technische Hilfe und Jose Juan Lopez-Rubio für den Austausch der pUF1-Cas9 und pL6 Plasmide. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Bögen Foundation Awards, D.W.C. und H.M.K., UGA Start Mittel caracterización, Zuschüsse aus der March of Dimes Foundation (Basil O’Connor Starter Gelehrter Forschungspreis) gegangen und US National Institutes of Health gewährt (R00AI099156 und R01AI130139), caracterización und (T32AI060546), H.M.K.
Materials
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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