Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in Plasmodium Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden.
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Methodenartikel
CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Malaria ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität weltweit. Diese Krankheit, die vor allem in tropischen und subtropischen Regionen lebenden Menschen beeinflusst, verursacht durch Infektion mit Plasmodium -Parasiten. Die Entwicklung wirksamer Medikamente zur Bekämpfung der Malaria kann durch ein besseres Verständnis der Biologie dieser komplexen Parasiten beschleunigt werden. Genetische Manipulation dieser Parasiten ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer Biologie; Allerdings ist historisch das Genom von p. Falciparum schwierig zu handhaben gewesen. Vor kurzem wurde CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung im Malaria-Parasiten, zulassend einfacher Protein tagging, Erzeugung von bedingten Protein Niederschlägen und Löschung von Genen genutzt. CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung erweist sich ein mächtiges Werkzeug für die Förderung der Malaria-Forschung. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9 Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in p. Falciparum. Diese Methode ist sehr anpassungsfähig an andere Arten von genetischen Manipulationen, einschließlich Protein-tagging und gen Knockouts.
Einleitung
Malaria ist eine verheerende Krankheit verursacht durch Protozoen Parasiten der Gattung Plasmodium. P. Falciparum, der meisten tödlichen menschlichen Malaria-Parasiten verursacht rund 445.000 Todesfälle pro Jahr, meist bei Kindern unter dem Alter von fünf1. Plasmodium -Parasiten haben einen komplizierten Lebenszyklus mit einem Moskito Vektor und ein Wirbeltier Host. Menschen infizieren sich zunächst eine infizierte Mücke eine Blutmahlzeit nimmt. Dann der Parasit dringt in die Leber, wo es wächst, entwickelt sich und teilt für etwa eine Woche. Nach diesem Vorgang sind die Parasiten in den Blutkreislauf freigesetzt, wo ....
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Protokoll
Kontinuierliche Kultur von p. Falciparum erfordert den Einsatz von menschlichen Erythrozyten, und wir nahmen im Handel erworbene Einheiten des Blutes, die alle Bezeichner beraubt und anonymisiert wurden. Institutional Review Board und das Büro des Biosafety an der University of Georgia unsere Protokolle überprüft und genehmigt alle Protokolle, die in unserem Labor verwendet.
1. Wähle ein gRNA Sequenz
- Zur CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) und wählen Sie "Fasta Ziel". Fügen Sie unter "Ziel"die 200 Basenpaare von 3' Ende der offenen Leserahmen (ORF) eines Gens und 200 Basenpaaren von Anfang an das Gen ....
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Ergebnisse
Eine schematische Darstellung der Plasmide verwendet diese Methode als auch ein Beispiel für ein Schild-Mutation sind in Abbildung 1dargestellt. Als ein Beispiel dafür, wie mutierte Parasiten nach Transfektion identifizieren sind Ergebnisse von PCRs zur Integration desquantifizierten Konstrukts HA - Überprüfung in Abbildung 2dargestellt. Ein repräsentatives Bild einer Klonen Platte ist in Abbildung 3.......
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Diskussion
Die Umsetzung der CRISPR/Cas9 in p. Falciparum hat sowohl erhöht die Effizienz und verringert den Zeitaufwand für die Änderung der Parasit Genom, im Vergleich zu bisherigen Methoden der genetischen Manipulation. Dieses umfassende Protokoll beschreibt die Schritte, die notwendig für die Erzeugung von bedingten Mutanten mit CRISPR/Cas9 in p. Falciparum. Während die Methode hier speziell für die Generation von HA -quantifizierten Mutanten ausgerichtet ist, kann diese Strategie für eine Vielzahl vo.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Muthugapatti Kandasamy Herzstück der University of Georgia (UGA) biomedizinischen Mikroskopie für technische Hilfe und Jose Juan Lopez-Rubio für den Austausch der pUF1-Cas9 und pL6 Plasmide. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Bögen Foundation Awards, D.W.C. und H.M.K., UGA Start Mittel caracterización, Zuschüsse aus der March of Dimes Foundation (Basil O'Connor Starter Gelehrter Forschungspreis) gegangen und US National Institutes of Health gewährt (R00AI099156 und R01AI130139), caracterización und (T32AI060546), H.M.K.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gene Pulser Xcell Elektroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Elektroporator | Bio-Rad | 165-2086 | Wir kaufen diejenigen, die einzeln verpackt sind |
| Natriumacetat | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Geschenk von Akhil Vaidya Labor | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Gewebekultur 6 Well Platten | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Gewebekulturschalen (12 mL Platte) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Gewebekultur 96 Well Platten | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Gewebekultur 24 Well Platten | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | ||
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop Flaschenaufsatz-Filtereinheit | Millipore | SCGPU10RE | Sie können jede Größe verwenden, die Ihren Anforderungen entspricht |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Erzeugt durch das Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Erzeugt durch das Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Geschenk aus dem Jose-Juan Lopez-Rubio Labor | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Natriumpyruvat | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthin | Sigma-Aldrich | H9636-25G | |
| Gentamicin-Reagenz | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidin | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD, | erzeugt durch das Muralidharan Lab | ||
| Puf1-Cas9 eGFP gRNA | erzeugt durch das Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel und PCR-Aufreinigung | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N / A | Sie werden ein paar Chargen ausprobieren wollen, um herauszufinden, was die Parasiten am besten wachsen |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | E-Mail oder rufen Sie sie direkt an, um zu bestellen | Wir verwenden normalerweise O + Blut |
| 3D7 Parasitenlinie | Erhältlich auf Anfrage | N / A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | Sie können Ihre eigenen herstellen, es ist nicht notwendig, genau dieses |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | zu verwenden Wir stellen eine 1000X Aktie bei 100mg/ml in Wasser her und lagern in der -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | Sie können Ihre bevorzugte Ladesteuerung für Western Blots verwenden. Dies ist nur das, was wir in unserem Labor verwenden |
| Ratte Anti-HA Klon 3F10, monoklonal | Hergestellt von Roche, verkauft von Sigma | 11867423001 | Sie können Ihren bevorzugten Anti-HA-Antikörper |
| verwenden 0,6 mL Röhrchen | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOKOLL* Hema 3* Manuelles Färbesystem (Fixativ + Lösung I und II) | Fisher | 22-122-911 | Sie können auch Giemsa-Färbung verwenden |
| Fisherfines Premium mattierte Objektträger - Größe: 3 x 1 Zoll | Fischer | 12-544-3 |
Referenzen
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
