CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum
Summary
Vi beskriver en metode for å generere glmS-basert betinget knockdown mutanter i Plasmodium falciparum bruker CRISPR/Cas9 genomet redigering.
Abstract
Malaria er en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Denne sykdommen, som hovedsakelig påvirker de som lever i tropiske og subtropiske områder, skyldes infeksjon med Plasmodium parasitter. Utvikling av mer effektiv narkotika for å bekjempe malaria kan akselereres ved å forbedre vår forståelse av biologi denne komplekse parasitten. Genetisk manipulering av disse parasittene er nøkkelen til å forstå deres biologi; men har historisk genomet av P. falciparum vært vanskelig å manipulere. Nylig har CRISPR/Cas9 genomet redigering blitt utnyttet under parasitten, noe som åpner for enklere protein merking, generasjon av betinget protein bokseren, og sletting av gener. CRISPR/Cas9 genomet redigering har vist seg for å være et kraftig verktøy for å fremme feltet malaria forskning. Her beskriver vi en CRISPR/Cas9-metoden for å generere glmS-basert betinget knockdown mutanter i P. falciparum. Denne metoden er svært tilpasningsdyktige til andre typer genetisk manipulasjon, inkludert protein merking og gene fortrenging.
Introduction
Malaria er en ødeleggende sykdom forårsaket av protozoan parasitter av slekten Plasmodium. P. falciparum, de fleste dødelig menneskelig malariaparasitten, forårsaker ca 445.000 dødsfall per år, hovedsakelig i barn under fem1. Plasmodium parasitter har en intrikat livssyklus som involverer en mygg vektor og en virveldyr vert. Mennesker bli først infisert når en infisert mygg tar en blod måltid. Deretter invaderer parasitten leveren hvor det vokser, utvikler og deler i ca en uke. Etter denne prosessen frigis parasitter i blodet, hvor de gjennomgå aseksuell replikering i røde blodceller (RBCs). Veksten av parasitter i RBCs er direkte ansvarlig for kliniske symptomer assosiert med malaria2.
Inntil nylig var produksjonen av transgene P. falciparum en arbeidskrevende prosess, som involverer flere runder med narkotika utvalg som tok mange måneder og hadde en høy strykprosent. Dette tidkrevende prosedyre relieson bryter generering av tilfeldige DNA i regionen rundt og endogene evnen av parasitten å reparere dens Genova skjønt homologe reparasjon3,4,5,6 . Nylig har gruppert regelmessig Interspaced Palindromic gjenta/Cas9 (CRISPR/Cas9) genomet redigering blitt vellykket utnyttet i P. falciparum7,8. Innføringen av denne nye teknologien i malaria forskning har vært avgjørende for fremme forståelse av biologi av disse dødelige Plasmodium parasitter. CRISPR/Cas9 gir spesifikke målretting av gener gjennom guide RNAs (gRNAs) som er homologe til genet av interesse. GRNA/Cas9 komplekse gjenkjenner genet gjennom gRNA, og Cas9 deretter introduserer en dobbel-strand pause, tvinge initiering av reparasjonsmekanismene i organismen9,10. Fordi P. falciparum mangler maskiner for å reparere DNA bryter gjennom ikke-homologe slutten å delta, det utnytter homologe rekombinasjon mekanismer og integrerer transfekterte homologe DNA maler for å reparere Cas9/gRNA-indusert dobbel-strand pause11,12.
Her presenterer vi en protokoll for generering av betinget knockdown mutanter i P. falciparum bruker CRISPR/Cas9 genomet redigering. Protokollen demonstrerer bruken av glmS ribozyme til betinget knockdown protein nivåer av PfHsp70x (PF3D7_0831700), en Anstandsdame eksporteres av P. falciparum til verten RBCs13,14. GlmS -ribozyme aktiveres ved behandling med glucosamine (som er konvertert til glucosamine-6-fosfat i celler) for å holde seg sin tilknyttede mRNA, fører til en reduksjon i protein14. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å utnytte andre betinget knockdown verktøy, for eksempel destabilisering domener eller RNA aptamers4,5,15. Våre protokollen detaljer generering av en reparasjon plasmider bestående av en hemagglutinin (HA) koden og glmS ribozyme koding sekvens flankert av sekvenser som er homologe til PfHsp70x åpent lesing rammen (ORF) og 3-UTR. Vi beskriver også generering av en andre plasmider til stasjonen uttrykk for gRNA. Disse to plasmider, samt en tredje som driver uttrykk for Cas9, er transfekterte i RBCs og brukes til å endre genomet av P. falciparum parasitter. Til slutt, beskriver vi en polymerasekjedereaksjons (PCR)-basert teknikk for å kontrollere integrering av koden og glmS ribozyme. Denne protokollen er svært tilpasningsdyktige for endring eller fullstendig knockout av noen P. falciparum gener, styrke vår evne til å generere ny innsikt i biologi av malariaparasitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gjennomføringen av CRISPR/Cas9 i P. falciparum har både for og redusert mengden tid for å endre det parasite genom, sammenlignet med tidligere metoder for genetisk manipulasjon. Denne omfattende protokollen beskriver trinnene nødvendig for å generere betinget mutanter bruker CRISPR/Cas9 i P. falciparum. Mens metoden her er rettet spesielt for generering av HA –glmS mutanter, kan denne strategien tilpasses for ulike behov, inkludert merking av gener, gene fortrenging og innføring av punkt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Muthugapatti Kandasamy ved University of Georgia (UGA) biomedisinsk mikroskopi kjernen for kundestøtte og Juan Jose-Lopez-Rubio for deling plasmider pUF1-Cas9 og pL6. Dette arbeidet ble støttet av BUER Foundation priser D.W.C. og H.M.K., UGA oppstart midler til V.M., tilskudd fra mars Dimes Foundation (basilikum O’Connor Starter Scholar forskning Award) V.M. og oss National Institutes of Health gir (R00AI099156 og R01AI130139) til V.M. og (T32AI060546) til H.M.K.
Materials
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
