Vi beskriver en metode for å generere glmS-basert betinget knockdown mutanter i Plasmodium falciparum bruker CRISPR/Cas9 genomet redigering.
Malaria er en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Denne sykdommen, som hovedsakelig påvirker de som lever i tropiske og subtropiske områder, skyldes infeksjon med Plasmodium parasitter. Utvikling av mer effektiv narkotika for å bekjempe malaria kan akselereres ved å forbedre vår forståelse av biologi denne komplekse parasitten. Genetisk manipulering av disse parasittene er nøkkelen til å forstå deres biologi; men har historisk genomet av P. falciparum vært vanskelig å manipulere. Nylig har CRISPR/Cas9 genomet redigering blitt utnyttet under parasitten, noe som åpner for enklere protein merking, generasjon av betinget protein bokseren, og sletting av gener. CRISPR/Cas9 genomet redigering har vist seg for å være et kraftig verktøy for å fremme feltet malaria forskning. Her beskriver vi en CRISPR/Cas9-metoden for å generere glmS-basert betinget knockdown mutanter i P. falciparum. Denne metoden er svært tilpasningsdyktige til andre typer genetisk manipulasjon, inkludert protein merking og gene fortrenging.
Malaria er en ødeleggende sykdom forårsaket av protozoan parasitter av slekten Plasmodium. P. falciparum, de fleste dødelig menneskelig malariaparasitten, forårsaker ca 445.000 dødsfall per år, hovedsakelig i barn under fem1. Plasmodium parasitter har en intrikat livssyklus som involverer en mygg vektor og en virveldyr vert. Mennesker bli først infisert når en infisert mygg tar en blod måltid. Deretter invaderer parasitten leveren hvor det vokser, utvikler og deler i ca en uke. Etter denne prosessen frigis parasitter i blodet, hvor de gjennomgå aseksuell replikering i røde blodceller (RBCs). Veksten av parasitter i RBCs er direkte ansvarlig for kliniske symptomer assosiert med malaria2.
Inntil nylig var produksjonen av transgene P. falciparum en arbeidskrevende prosess, som involverer flere runder med narkotika utvalg som tok mange måneder og hadde en høy strykprosent. Dette tidkrevende prosedyre relieson bryter generering av tilfeldige DNA i regionen rundt og endogene evnen av parasitten å reparere dens Genova skjønt homologe reparasjon3,4,5,6 . Nylig har gruppert regelmessig Interspaced Palindromic gjenta/Cas9 (CRISPR/Cas9) genomet redigering blitt vellykket utnyttet i P. falciparum7,8. Innføringen av denne nye teknologien i malaria forskning har vært avgjørende for fremme forståelse av biologi av disse dødelige Plasmodium parasitter. CRISPR/Cas9 gir spesifikke målretting av gener gjennom guide RNAs (gRNAs) som er homologe til genet av interesse. GRNA/Cas9 komplekse gjenkjenner genet gjennom gRNA, og Cas9 deretter introduserer en dobbel-strand pause, tvinge initiering av reparasjonsmekanismene i organismen9,10. Fordi P. falciparum mangler maskiner for å reparere DNA bryter gjennom ikke-homologe slutten å delta, det utnytter homologe rekombinasjon mekanismer og integrerer transfekterte homologe DNA maler for å reparere Cas9/gRNA-indusert dobbel-strand pause11,12.
Her presenterer vi en protokoll for generering av betinget knockdown mutanter i P. falciparum bruker CRISPR/Cas9 genomet redigering. Protokollen demonstrerer bruken av glmS ribozyme til betinget knockdown protein nivåer av PfHsp70x (PF3D7_0831700), en Anstandsdame eksporteres av P. falciparum til verten RBCs13,14. GlmS -ribozyme aktiveres ved behandling med glucosamine (som er konvertert til glucosamine-6-fosfat i celler) for å holde seg sin tilknyttede mRNA, fører til en reduksjon i protein14. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å utnytte andre betinget knockdown verktøy, for eksempel destabilisering domener eller RNA aptamers4,5,15. Våre protokollen detaljer generering av en reparasjon plasmider bestående av en hemagglutinin (HA) koden og glmS ribozyme koding sekvens flankert av sekvenser som er homologe til PfHsp70x åpent lesing rammen (ORF) og 3-UTR. Vi beskriver også generering av en andre plasmider til stasjonen uttrykk for gRNA. Disse to plasmider, samt en tredje som driver uttrykk for Cas9, er transfekterte i RBCs og brukes til å endre genomet av P. falciparum parasitter. Til slutt, beskriver vi en polymerasekjedereaksjons (PCR)-basert teknikk for å kontrollere integrering av koden og glmS ribozyme. Denne protokollen er svært tilpasningsdyktige for endring eller fullstendig knockout av noen P. falciparum gener, styrke vår evne til å generere ny innsikt i biologi av malariaparasitten.
Gjennomføringen av CRISPR/Cas9 i P. falciparum har både for og redusert mengden tid for å endre det parasite genom, sammenlignet med tidligere metoder for genetisk manipulasjon. Denne omfattende protokollen beskriver trinnene nødvendig for å generere betinget mutanter bruker CRISPR/Cas9 i P. falciparum. Mens metoden her er rettet spesielt for generering av HA –glmS mutanter, kan denne strategien tilpasses for ulike behov, inkludert merking av gener, gene fortrenging og innføring av punkt …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Muthugapatti Kandasamy ved University of Georgia (UGA) biomedisinsk mikroskopi kjernen for kundestøtte og Juan Jose-Lopez-Rubio for deling plasmider pUF1-Cas9 og pL6. Dette arbeidet ble støttet av BUER Foundation priser D.W.C. og H.M.K., UGA oppstart midler til V.M., tilskudd fra mars Dimes Foundation (basilikum O’Connor Starter Scholar forskning Award) V.M. og oss National Institutes of Health gir (R00AI099156 og R01AI130139) til V.M. og (T32AI060546) til H.M.K.
Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
EGTA | Sigma | E4378-100G | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
Ampicilin | Clonetech | R050A | |
Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |