منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول للسماح للقياس الكمي الدقيق من الميتوكوندريا الحمض النووي (متدنا) مثلايشن. في هذا البروتوكول، يصف لنا هضم الأنزيمي للحمض النووي مع بامهي مقترنة بخط أنابيب تحليل bioinformatic التي يمكن استخدامها لتجنب المبالغة في تقدير مستويات مثلايشن متدنا الناجم عن هيكل متدنا الثانوية.
Abstract
التحديد الكمي للحمض النووي مثلايشن يمكن تحقيقه باستخدام تسلسل بيكبريتيت، الذي يستفيد من ممتلكات بيكبريتيت الصوديوم تحويل أونميثيلاتيد السيتوزين اليوراسيل، في سياق الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. يمكن أن يكون تسلسل بيكبريتيت المستهدفة (باستخدام PCR) أو تنفيذها على الجينوم كله ويوفر الكمي المطلق مثلايشن السيتوزين في القاعدة-قرار واحد. نظراً للطابع المميز للحمض النووي–والميتوكوندريا، لا سيما في هيكل الثانوية، ينبغي أدابتيونس بيكبريتيت يسلسل طرق التحقيق مثلايشن السيتوزين في متدنا. هيكل التعليم الثانوي والعالي من متدنا يمكن أن يؤدي في الواقع إلى بيكبريتيت تسلسل القطع الأثرية المؤدية إلى إيجابيات كاذبة بسبب وصول الفقراء تمسخ ناقصة بيكبريتيت الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام هضم الأنزيمي للحامض النووي مع بامهي مقترنة بأنابيب تحليل بيوينفورماتيك للسماح بالقياس الكمي الدقيق من السيتوزين مستويات مثلايشن في متدنا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا توفير مبادئ توجيهية لتصميم كبسولة تفجير تسلسل بيكبريتيت محددة إلى متدنا، تفاديا لاستهداف شرائح “النووية المتقدرية” غير مرغوب فيها (نومتس) إدراج الجينوم النووي.
Introduction
الجينوم المتقدرية بنية دائرية، مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل من حوالي 16.5-كيلو قاعدة (kb) منذ فترة طويلة، يشكل حبلا خفيفة وثقيلة. جينوم المتقدرية موجود في نسخ متعددة داخل كل خلية، الأمهات-الموروثة، وترميز المكونات الأساسية ل مجمعات سلسلة التنفس1. مماثلة للجينوم البكتيري وخلافا للجينوم النووي، الجينوم المتقدرية هو نظمت في عدة هياكل التعليم الثانوي والعالي، كما هو الحال في هياكل ملفوف وسوبيركويليد2، التي يمكن أن تجعل الوصول الصعب أثناء تسلسل 3من التجارب.
في النواة، مثلايشن من الحمض النووي هو علامة جينية درس على نطاق واسع أن يؤدي دوراً في عمليات عديدة، ولا سيما في تنظيم التعبير الجيني. في جينومات الثدييات، مثلايشن الحمض النووي يحدث أساسا في 5-موقف حلقة بيريميدين ديوكسيسيتيدينيس، معظمهم في دينوكليوتيديس الفريق الاستشاري (أو الدليل). يوجد مثلايشن السيتوزين في 70 في المائة من جميع البد في الجينوم من خلايا جسدية وحسابات ~ 1 في المائة من مجموع قواعد الحمض النووي4. ميثيليشنز الحمض النووي قد وصفت أيضا في سياقات غير المعبأة، مثل اتفاق السلام الشامل ولجنة مناهضة التعذيب، والحزب الشيوعي الصيني، وتوجد بكميات مختلفة في الحمض النووي، بقيم تصل إلى 25 في المائة من جميع سيتوسينيس ميثليته في الخلايا الجذعية الجنينية5،،من67.
بينما مثلايشن السيتوزين الجينوم النووي مقبول على نطاق واسع، وجود الميتوكوندريا الحمض النووي (متدنا) مثلايشن لا تزال مثيرة للجدل. مثلايشن متدنا التحقيق الأولى دراسة أجريت في الخلايا المستزرعة حيث سهولة تم اكتشاف مثلايشن متدنا، على الرغم من أن مستويات أدنى بالمقارنة مع الحمض النووي8. في الخلايا البشرية وموريني، اكتشفت أيضا مثلايشن متدنا عند مستويات منخفضة (2-5%). استخدام فحوصات الاعتماد على التقاط ميثيلسيتوسيني 5 مثل ميثليته الحمض النووي إيمونوبريسيبيتيشن (مدب) تليها PCR الكمي، مثلايشن متدنا واكتشفت أيضا في مختلف الماوس والإنسان وخلايا خطوط9،10، 11،12. استخدام الأجسام المضادة ضد 5-ميثيلسيتوسيني في تحليل إليزا أو الكتلي، تم الكشف عن مستويات كبيرة من الحمض النووي مثلايشن من الكسور المتقدرية المنقي13،،من1415، 16-ومع ذلك، يستخدم معظم فحوصات في الدراسات السالفة الذكر التقنيات التي لم تصمم لتقديم التقدير الكمي المطلق مثلايشن الحمض النووي في القاعدة واحدة-القرار.
تحليل كمي مثلايشن الحمض النووي يمكن أن يتحقق بأسلوب المسمى “بيكبريتيت التسلسل”، الذي يستفيد من ممتلكات بيكبريتيت الصوديوم تحويل أونميثيلاتيد السيتوزين اليوراسيل في واحد–الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي سياق17 . باستخدام تسلسل بيكبريتيت، كشف كوكبة من الدراسات عن وجود مثلايشن السيتوزين على مختلف المستويات. واكتشفت متدنا مثلايشن في منطقة د-حلقة أو 12S منطقة 16S سهولة في البشرية18،19،20،21،،من2223 والماوس24 الأنسجة والخلايا، ولكن مع التقلبات مثيرة للاهتمام، من 1-20% من مجموع سيتوسينيس عبر الدراسات.
بالمقارنة مع العديد من هذه الدراسات، المتنازع عليها وجود متدنا مثلايشن3،25،،من2627 سوى عدد قليل من الدراسات، بما في ذلك من مجموعتنا، أو يتشكك في صلة بيولوجية مستويات منخفضة جداً من متدنا مستويات (أقل من 2%)28. في الآونة الأخيرة، أبلغنا بمراقبة قطعة أثرية بيكبريتيت-تسلسل المحتملة في تسلسل بيكبريتيت المتقدرية كله3. وقدمنا الأدلة الثانوية بنية الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى إيجابيات كاذبة في تسلسل بيكبريتيت، يمثلهم وبالتالي مستويات مثلايشن. نحن نقدم هنا بروتوكولا لمنع قطعة أثرية من بيكبريتيت-تحويل متدنا. يستخدم هذا البروتوكول هضم الأنزيمي بسيطة من الحمض النووي لتعطيل الهياكل الثانوية متدنا والسماح بالوصول الكامل إلى بيكبريتيت عقب بيكبريتيت تسلسل بروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم خط أنابيب بيوينفورماتيك مصاحبة لتحليل تسلسل بيكبريتيت.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن نقدم بروتوكول بيكبريتيت التسلسل الذي تم تصميمه خصيصا لاستجواب مثلايشن متدنا. الخلافات مع بيكبريتيت-تسلسل البروتوكولات المستخدمة للحمض النووي يكمن في الاستفادة من خطوة سابقة تقييد إنزيم هضم وتحليل بيوينفورماتيك الحزب الحاكم من الإيجابية الكاذبة الناجمة عن تسلسل نومت.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نوفو نورديسك مؤسسة مركز أبحاث الأيض الأساسية مركز بحوث مستقلة في جامعة كوبنهاغن ممولة جزئيا من قبل منحة غير مقيد من مؤسسة نوفو نورديسك.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D’Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down’s syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -. M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. . Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
