Summary
Her diskuterer vi en række protokoller for induktion og validering af cellulære gulne i kulturperler celler. Vi fokuserer på forskellige gulne-inducerende stimuli og beskrive kvantificering af fælles gulne-associerede markører. Vi leverer tekniske detaljer ved hjælp af fibroblaster som model, men protokollerne, der kan tilpasses til forskellige cellulære modeller.
Abstract
Cellulære ældning er en tilstand af permanent celle cyklus anholdelse aktiveret som svar på forskellige skadelige stimuli. Aktivering af cellulære gulne er kendetegnende for forskellige patofysiologiske forhold herunder tumor undertrykkelse, væv remodellering og aldring. Induktorer af cellulære gulne i vivo karakteriseres stadig dårligt. Imidlertid kan en række stimuli bruges til at fremme cellulære gulne ex vivo. Blandt dem er mest almindelige gulne-induktorer replicative udmattelse, ioniserende og ioniserende stråling, genotoksiske stoffer, oxidativ stress, og demethylating og acetylating agenter. Her vil vi give detaljerede instruktioner om hvordan man bruger disse stimuli til at fremkalde fibroblaster til ældning. Denne protokol kan let tilpasses til forskellige typer af primærelementer og cellelinjer, herunder kræftceller. Vi beskriver også forskellige metoder til validering af gulne induktion. Især fokuserer vi på måler aktiviteten af den lysosomale enzym gulne-associerede β-galactosidase (SA-β-gal), antallet af DNA-syntese ved hjælp af 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) iblanding assay, niveauer af udtryk af cellecyklus hæmmere p16 og p21, og udtryk og sekretion af medlemmer af Senescence-Associated sekretoriske fænotype (SASP). Endelig, vi leverer eksempel resultater og drøfte yderligere anvendelser af disse protokoller.
Introduction
I 1961 rapporteret Hayflick og Moorhead at primære fibroblaster i kultur miste deres proliferativ potentiale efter hinanden følgende passager1. Denne proces er forårsaget af den sekventielle afkortning af telomerer efter hver celledeling. Når telomerer nå en kritisk kort længde, genkendes de af DNA-skader svar (DDR), der aktiverer en irreversibel anholdelse af spredning — også defineret som replicative ældning. Replicative gulne er i øjeblikket en af de mange stimuli, der er kendt for at fremkalde en tilstand af permanent celle cyklus anholdelse, der gengiver celler ufølsomme både mitogens og apoptotiske signaler2,3. Programmet gulne er normalt karakteriseret ved yderligere funktioner herunder høj lysosomale aktivitet, mitokondriel dysfunktion, nukleare ændringer, kromatin rearrangementer, endoplasmatiske reticulum stress, DNA-skader og en gulne-associerede sekretoriske fænotype (SASP)3,4. Senescent celler har flere funktioner i kroppen: udvikling, sår healing og tumor undertrykkelse2. Ligeledes er de kendt for at spille en vigtig rolle i aging og paradoksalt nok i tumor progression5. Negative, og delvist modstridende, virkningerne af gulne er ofte tilskrives SASP6.
For nylig, blev det vist, at fjernelse af senescent celler fra mus fører til levetid udvidelse og afskaffelse af mange af de forældelsesperiode funktioner7,8,9,10,11, 12. flere stoffer på samme måde, er blevet udviklet til enten fjerne senescent celler (senolytics) eller at målrette SASP13,14. Anti-aging terapeutiske potentiale har for nylig tiltrak mere opmærksomhed til feltet.
Studiet af mekanismer forbundet til cellulære gulne og screeninger for farmakologiske interventioner er stærkt afhængige af ex vivo modeller, især på menneskers primære fibroblaster. Mens der er nogle fælles funktioner aktiveres af forskellige gulne induktorer, er en stor variation i gulne fænotype observeret og afhængig af forskellige faktorer, herunder celle type, stimulus og tid punkt3,15, 16,17. Det er bydende nødvendigt at overveje heterogenitet for at studere og målretning af senescent celler. Derfor, denne protokol har til formål at give en række metoder, der anvendes til at fremkalde gulne i primære fibroblaster ved hjælp af forskellige behandlinger. Som det vil blive forklaret, kan metoderne, der let tilpasses til andre celletyper.
Bortset fra replicative gulne, vi beskriver fem andre gulne-inducerende behandlinger: ioniserende stråling, ultraviolet (UV) stråling, doxorubicin, oxidativ stress og epigenetiske ændringer (nemlig fremme af Histon acetylation eller DNA demetylering) . Både, ioniserende stråling og UV-stråling direkte DNA skade og den passende dosis, udløse gulne18,19. Doxorubicin også forårsager ældning hovedsagelig gennem DNA-skader ved intercalating i DNA og forstyrre topoisomerase II funktion og dermed standse DNA reparation mekanismer20. Udtryk af gener, der er afgørende for gulne styres normalt af Histon acetylation og DNA methylering. Som følge heraf udløse Histon deacetylase hæmmere (f.eks., natrium butyrat og SAHA) og DNA demethylating (f.eks. 5-aza) agenter gulne i ellers normale celler21,22.
Endelig fire af de mest almindelige markører tilknyttet senescent celler vil blive forklaret: aktivitet af den gulne forbundet-β-galactosidase (SA-β-gal), sats af DNA syntese af EdU indarbejdelse assay, overekspression af cellecyklus tilsynsmyndigheder og cyclin-afhængig kinase-hæmmere p16 og p21, og overekspression og sekretion af medlemmer af SASP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generelle forberedelse
- Forberede D10 medium. Supplere DMEM medium-Glutamax med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin (endelig koncentration: 100 U/mL).
- Forberede steril PBS. Opløse tabletterne i vand efter fabrikantens anvisninger. Steriliseres ved autoklavering.
- Forberede 1 x trypsin. Fortynd 5 mL Trypsin-Versene EDTA/10 x 1:10 i 45 mL steril PBS.
Bemærk: I hele protokollen, vi bruger celle kultur betingelser, der er tættere på de fysiologiske betingelser for primære fibroblaster. Det betyder, at vi Inkuber celler ved 37 ° C og 5% CO2 , som er normalt udført men bruge 5% O2 i stedet for den "standard" 20% O2. - Håndtere alle prøver i sterile forhold ved hjælp af et laminar flow hood, laboratoriekittel og handsker. Hold celler på 20% O2 (lokaleforhold) kun mens bliver håndteret.
2. induktion af ældning
- Replicative gulne
- Mens håndtering af celler eller materiale, der vil være i kontakt med dem (pipets, kolber, medier, etc.) arbejder under sterile forhold, ved hjælp af et laminar flow hood, laboratoriekittel og handsker. Hold celler på 20% O2 (lokaleforhold) kun mens bliver håndteret.
- Seed 7 x 105 levedygtige primære fibroblaster i en lav befolkningstæthed fordobling (PD) i en T75 kolbe (~9.3 x 103 celler/cm2) indeholder 10 mL af D10.
- Vokse celler i en celle inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2 , indtil de når 70 – 80% sammenløbet (3 – 4 dage for prolifererende kulturer i en lav PD).
- Frigør de celler ved hjælp af 3 mL 1 x trypsin og inkubere for ~ 5-7 min. i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2. Overvåge cellerne regelmæssigt med en celle kultur mikroskop for at kontrollere den fjernelse proces.
- Når celler er kugleformet, trypsin reaktionen standses ved at tilføje 9 mL D10. Ikke udruge længere end 10 min.
- Spin celler på 300 x g for 5 min. celler vil danne en pellet i bunden af røret, mens debris og mindre partikler vil forblive i supernatanten.
- Fjern supernatanten og opløse celle pellet i 1 mL D10 og udføre en celletal, ved hjælp af en automatiseret celle tæller efter fabrikantens anvisninger eller et Neubauer kammer til manuel optælling. Mens optællingen, omfatte en analyse for at tjekke levedygtigheden af cellerne (f.eks., Trypan blå udstødelse23).
- Beregn den kumulative PD bruger denne formel:
PDnye = 3.32* (LOG(cell number total)-(LOG (celle nummer seedet)) + PDold
Cell antal samlede = alle celler tælles: døde og levende.
Celle nummer seedede = antallet af levedygtige celler seedede (8 x 105 celler).
PDgamle = befolkning fordobling på tidspunktet for såning.
PDnye = befolkning fordobling for øjeblikket af tælle (efter inkubation).
Bemærk: Hvis 7 x 105 primære fibroblaster (PD 35,2) var seedet på en T-75 kolbe, og efter 4 dage de nå 80% sammenløbet og deles igen, tæller nu 1,3 x 106 samlede celler (død + levende).
PDnye = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
PDnye = 36.1 - Reseed 8 x 105 celler i en ny T75, gentage trin 2.1.2–2.1.8.
Bemærk: Efter flere på hinanden følgende passager, vil kulturen tage længere tid at få sammenflydende indtil celler stop dividere overhovedet. Når celler stop dividere, test for gulne markører og/eller høst for efterfølgende ansøgninger. - Mener, at den større størrelse af senescent celler kan forårsage kultur skal vises fuld og endnu har et lavt celletal. Således gulne kan antages, når PD er stabil og andre gulne markører vises i kultur (Se protokoller 3.1-3.5).
Bemærk: Brug prolifererende primære fibroblaster som kontrol.
- Ioniserende stråling-induceret gulne
- Mens håndtering af celler eller materiale, der vil være i kontakt med dem (pipets, kolber, medier, osv.), arbejde under sterile forhold ved hjælp af et laminar flow hood, laboratoriekittel og handsker. Hold celler på 20% O2 (lokaleforhold) kun mens bliver håndteret.
- Seed 7 x 105 levedygtige primære fibroblaster i en lav PD i en T75 kolbe (~9.3 x 103 celler/cm2) indeholder 10 mL af D10.
- Inkuber celler natten over i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Udsætte celler til 10 grå af gammastråling ifølge vejledningen i maskinen i brug.
- Opsug medium fra celler og erstatte med 10 mL af D10.
- Inkuber celler i 10 mL af D10 i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2 for en anden 10 dage erstatter mediet regelmæssigt, ca hver 3 dage.
- Efter 10 dage, test for gulne markører og/eller bruge cellerne for efterfølgende ansøgninger.
Bemærk: Brug prolifererende primære fibroblaster af samme PD (inden bestråling) som kontrol.
- Ultraviolet (UV) induceret stråling-gulne
- Mens håndtering af celler eller materiale, der vil være i kontakt med dem (pipets, kolber, medier, osv.), arbejde under sterile forhold ved hjælp af et laminar flow hood, laboratoriekittel og handsker. Hold celler på 20% O2 (lokaleforhold) kun mens bliver håndteret.
- Frø 1,5 – 2 x 105 levedygtige primære fibroblaster i en lav PD i et godt af en 6-godt plade (1,5-2,0 x 104 celler/cm2), der tilsættes 2 mL af D10 medium.
- Placer cellerne i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2 og lad dem til at overholde plast i mindst 5 timer.
- Tag mediet fra cellerne. 6-godt pladen anbringes i midten af UV-stråling kammer og tage den plast låg. Bestråle med UVB, 20 – 30 mJ/cm2.
- Der tilsættes 2 mL medium pr. brønd.
- Inkuber celler i 2 mL af D10 i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2 for det andet 7 dage erstatter mediet regelmæssigt, ca hver 3 dage.
Bemærk: Efter 7 dage, celler kan blive testet for gulne markører og anvendes til downstream applikationer. Bruge prolifererende primære fibroblaster af samme PD (inden bestråling) som kontrol.
- Doxorubicin-induceret gulne
- Forberede 1.000 x Doxorubicin stamopløsning: gøre en 250 µM bestand af Doxorubicin i 1 x PBS, filter-sterilisere løsning og alikvot i 500 µL pr. sterile rør. Butik doxorubicin bestanden ved-80 ° C.
- Mens håndtering af celler eller materiale, der vil være i kontakt med dem (pipets, kolber, medier, osv.), arbejde under sterile forhold ved hjælp af et laminar flow hood, laboratoriekittel og handsker. Hold celler på 20% O2 (lokaleforhold) kun mens bliver håndteret.
- Seed 7 x 105 levedygtige primære fibroblaster i en lav PD i en T75 kolbe (~9.3 x 103 celler/cm2) indeholder 10 mL af D10.
- Inkuber celler natten over i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Fortynd 11 µL af 1.000 x doxorubicin stamopløsning i 11 mL D10 i en endelig koncentration på 250 nM.
- Opsug medium fra celler og erstatte med 10 mL af D10 + doxorubicin.
- Inkuber celler i præcis 24 timer i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Opsug medium fra cellerne og omhyggeligt vaskes en gang med 10 mL af D10.
- Inkuber celler i 10 mL af D10 for en anden 6 dage erstatter mediet regelmæssigt, ca hver 3 dage.
- På dag 7, test for gulne markører og/eller brug for efterfølgende ansøgninger.
Bemærk: som kontrol, brug prolifererende primære fibroblaster af samme PD behandlet i 24 timer med køretøjet (PBS) 1:1,000 i D10.
- Oxidativ Stress-induceret gulne
- Mens håndtering af celler eller materiale, der vil være i kontakt med dem (pipets, kolber, medier, etc.) arbejder under sterile forhold ved hjælp af et laminar flow hood, laboratoriekittel og handsker. Hold celler på 20% O2 (lokaleforhold) kun mens bliver håndteret.
- Seed 7 x 105 levedygtige primære fibroblaster i en lav PD i en T75 kolbe (~9.3 x 103 celler/cm2) indeholder 10 mL af D10.
- Inkuber celler natten over i en celle inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Der fremstilles en opløsning af ~ 200 μM hydrogenperoxid i D10 medium ved at tilføje 22,6 μl 30% hydrogenperoxid i 11 mL D10.
Bemærk: Optimere behandlingen for celletype af interesse ved at gøre en kurve dosis-respons til at evaluere toksicitet. - Opsug medium fra cellerne, og der tilsættes 10 mL af frisklavede D10 medium + hydrogen peroxid. Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Opsug medium fra cellerne og vaske en gang med friske D10 uden hydrogenperoxid.
- Der tilsættes 10 mL af D10 uden hydrogenperoxid.
- Der inkuberes i 48 timer i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Gentag trin 2.5.4–2.5.8 to gange mere i alt tre behandlinger.
- Check for gulne markører eller høst for efterfølgende ansøgninger.
Bemærk: Som kontrol, brug prolifererende celler af samme PD behandlet med 22,6 µL sterilt vand i D10 for 2 h.
- Epigenetically-induceret gulne
- Forberede materiel og fungerende løsninger for den lille molecule(s) til brug i henhold til tabel 1. Filter-sterilisere løsningerne. Alikvot i sterile rør. Opbevares ved-20 ° C.
- Mens håndtering af celler eller materiale, der vil være i kontakt med dem (pipets, kolber, medier, etc.) arbejder under sterile forhold, for eksempel ved hjælp af et laminar flow hood, laboratoriekittel og handsker. Hold celler på 20% O2 (lokaleforhold) kun mens bliver håndteret.
- Seed 7 x 105 levedygtige primære fibroblaster i en lav PD i en T75 kolbe (~9.3 x 103 celler/cm2) indeholder 10 mL af D10.
- Inkuber celler natten over i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Forberede den ønskede behandling 11 mL D10 medium + brugsopløsning. Den nøjagtige fortynding pr. behandling kan ses i tabel 1.
- Forberede 11 µL af 1 mM SAHA brugsopløsning i 11 mL D10.
- Forberede 44 µL 1 M natrium butyrat brugsopløsning i 11 mL D10.
- Forberede 11 µL af 10 mM 5-aza brugsopløsning i 11 mL D10.
Bemærk: Optimere behandlinger for celletype af interesse, for eksempel, at gøre en kurve dosis-respons til at evaluere toksicitet.
- Tilføje D10 medium + brugsopløsning til den ønskede behandling til kulturen.
- Der inkuberes i 24 timer i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Gentag trin 2.6.4–2.6.6 to gange mere, for i alt tre behandlinger.
- Ændre medium for simple D10 uden narkotika.
- Efter 3 dage mere bliver celler senescent og klar til afprøvning af gulne markører og downstream applikationer.
Bemærk: som kontrol, brug prolifererende primære fibroblaster af samme PD behandlet i tre dage med D10 medium + køretøj. D10 medium + køretøj skal opdateres hver 24 timer i løbet af de tre dage. Køretøjet afhænger behandlingen anvendes: 1:1,000 DMSO for SAHA og 5-aza og 1:250 sterilt vand for natrium butyrat.
3. markører for ældning
- Forberedelse
- Forberede 20 mg/mL X-gal: 20 mg X-gal i 1 mL dimethylformamid eller DMSO opløses. Opbevares ved-20 ° C beskyttet mod lys.
- Forberede 0,1 M citronsyre løsning: 2,1 g citronsyre monohydrat i 100 mL vand opløses. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede 0,2 M natriumfosfat løsning: opløses 2,84 g natriumphosphat dibasiske eller 3.56 g af dibasiske natriumfosfat dehydrere i 100 mL vand. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede 0,2 M citronsyre/natrium fosfat pH 6.0: opløses 36.85 mL af 0,1 M citronsyre løsning og 63.15 mL 0,2 M natrium fosfat. Juster nøjagtigt til pH 6.0. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede 100 mM kaliumferrocyanid: 2,1 g kaliumferrocyanid i 50 mL vand opløses. Opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys.
- Forberede 100 mM kalium Ferricyanid: 1,7 g kalium Ferricyanid i 50 mL vand opløses. Opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys.
- Forberede 5 M natriumchlorid: 14,6 g natriumchlorid i 50 mL vand opløses. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede 1 M magnesiumchlorid: 4,8 g magnesiumchlorid i 50 mL vand opløses. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede 2% formaldehyd + 0,2% glutaraldehyd i PBS: opløses 800 µL af 25% glutaraldehyd og 12,5 µL af 16% formaldehyd i 100 μL af PBS. Opbevares ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Forberede Farvningsopløsningen friske ifølge tabel 2.
- Gulne-associerede β-galactosidase farvning
- For hver prøve, frø 1 x 104 celler i mindst én godt af en 24-godt plade (5.2 x 103 celler/cm2) indeholder 500 µL af D10 således at cellerne er sparsomme. Behandlinger (hvis relevant) kan udføres direkte på denne plade, eller alternativt celler behandles allerede kan være re seedede i en 24-godt plade.
- Inkuber celler natten over ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Vaske cellerne to gange med 500 μL af PBS.
- Fix 3-5 min ved stuetemperatur bruger 500 μL/brønd af 2% formaldehyd + 0,2% glutaraldehyd i PBS.
- Vaske cellerne to gange med 500 μL af PBS.
- Forberede frisk farvning løsning, afhængig af antallet af prøver til pletten.
- Tilføje Farvningsopløsningen (500 µL/brønd) og forsegle pladen med parafilm at undgå fordampning.
Bemærk: Fordampning kan forårsage krystaller til formen og hindrer observation under mikroskop. - Inkuber celler i mørke (f.eks. er omfattet af aluminiumsfolie) ved 37 ° C i en tør inkubator (uden CO2) for h-12 – 16.
Bemærk: CO2 kan påvirke pH og derfor ændre resultaterne. Nogle celletyper kan kræve kortere inkuberingstider. - Vaskes to gange med 500 μL af PBS.
- Vurdere resultaterne. Positive celler præsentere en blå (for det meste) perinuclear farvning under en normal lysmikroskop (figur 1A).
- Til kvantificering, observere mindst 100 celler pr. sample og tælle antallet af positive celler. Da senescent celler Skift figur, er det ofte vanskeligt at definere cellegrænserne og tælle cellerne. Kontrastfarve med DAPI at lette visualisering og kvantificering af individuelle celler (figur 1B). Kvantificere prøver (procentdel af positive celler versus samlede antal celler) ved hjælp af en fluorescerende mikroskop (figur 1 c). Tage flere billeder af den samme prøve, så i slutningen du kan tælle mindst 100 enkelt-celler og evaluere procentdelen af SA-β-gal positive celler i dem.
- Sammenlign resultaterne af senescent celler versus deres passende kontrol til behandling anvendes.
Bemærk: En co farvning med EdU på samme prøve er muligt. Overveje at celler derefter være seedet på coverslips.
- EdU indarbejdelse Assay
- Sætte en coverslip/brønd i en 24-godt plade afhængig af antallet af prøver, der skal vurdere.
- Frø 1 x 104 celler i mindst én godt af en 24-godt plade (5.2 x 103 celler/cm2) pr. betingelse der indeholder 500 µL af D10, således at cellerne er sparsomme. Behandlinger (hvis relevant) kan udføres direkte på denne plade, eller alternativt allerede behandlede celler kan være re seedede i en 24-godt plade.
- Inkuber celler natten over ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
- Gøre en 20 µM løsning af EdU i D10 (1:250) ud fra antallet af prøver at behandle (250 μL per prøve).
- Fjern halvdelen af medium (250 μL) fra hver brønd til at behandle og erstatte det med D10 + EdU løsning, der var bare forberedt. EdU slutkoncentration er 10 µM.
- Inkuber 18 – 24 h i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2. Brug den samme inkubationstiden i kontrol og senescent celler.
- Vask 2 x med 500 μL af PBS.
- Fix celler i 10 min med 500 μL af 4% formaldehyd i PBS.
- Inkuber 5 min i 500 μL 100 mm Tris (pH 7,6).
- Permeabilize celler i 10 min i 500 μl af 0,1% Triton X-100 i PBS.
- Vask 3 x med PBS.
- Forberede 50 μL af etiketten blanding for hver coverslip, tilføjer komponenterne i følgende rækkefølge: 44.45 µL af PBS, 0,5 µL af Cu (II) SO4, 0,05 µL af sulfo-Cy3-indeholder, 5 µL af natrium-Ascorbat.
- Sætte 50 μL af label-mix på et stykke af parafilm. Løft coverslip ved hjælp af et par pincet og en nål og lad det hvile oven på etiket mix, med den overflade, der indeholder de celler, der vender nedad. Sikre at der er ingen bobler og at hele overfladen af coverslip er rørende etiket mix. Inkuber i 30 min. i mørke.
- Sætte cellerne tilbage i wells af 24-godt-plade og vask dem tre gange med PBS.
- Mount med montering medier (herunder DAPI for at visualisere kerner) på glas dias og lad dem tørre natten over.
- Visualisere EdU indarbejdelse ved hjælp af et mikroskop for fluorescerende. Bruge et filter, der er relevante for Cy3 (excitation/emission: 552/570 nm).
- Tage flere billeder af celler til senere kvantificering af mindst 100 celler pr. betingelse (Cy3 og DAPI).
- Kvantificere procentdelen af celler, der indarbejdet EdU ved hjælp af følgende formel:
EdU positive celler (%) = (EdU positive celletal (Cy3) / samlet celletal (DAPI)) * 100 - Sammenlign resultaterne af senescent celler versus deres passende kontrol til behandling anvendes.
Bemærk: En co farvning med SA-β-gal på den samme prøve er muligt. Overveje at celler stadig være seedet på coverslips.
- Genekspression over p16, p21 og SASP
- Forberede primer-sæt af gener af interesse (50 µM primer).
Bemærk: En qPCR over p16, p21 og nogle relevante SASP faktorer er informative gulne status. Protokollen beskrevet her gør brug af Universal sonde bibliotek (UPL) system for relativ kvantificering ved hjælp af en realtid-PCR. Tabel 3 viser en oversigt over de primere, der anvendes til påvisning af CDK hæmmere p16 og p21 og de mest relevante SASP medlemmer samt til Tubulin og aktin, der tjener som reference gener for analysen. Den sidste kolonne i tabel 3 hverver bestemt UPL sonden skal anvendes til hvert assay. - Forbered særskilt qPCR mastermix for de ønskede assays. Altid omfatte henvisning gen samt ifølge tabel 4.
- Køre alle prøver i to eller tre eksemplarer.
- Indlæse 7,5 µL/brønd af qPCR mastermix på en 384-godt plade.
- Tilføje ~ 5 ng af cDNA opløst i 2,5 µL af RNase-fri vand.
Bemærk: Det er at foretrække at have tilsvarende mængder af cDNA for alle prøver skal sammenlignes. Dette kan opnås ved hjælp af lige store mængder af RNA til reverse transkription. - Dække pladen med en segl og sørg for at det holder sig korrekt dækker jævnt alle brøndene på pladen.
- Spin plade på 2.000 x g i 1 minut.
- Kør pladen i Lightcycler for 40 cyklusser ved hjælp af følgende protokol:
95 ° C i 7 min
40 cyklusser af 95 ° C til 5 s og 60 ° C i 30 s
37 ° C i 1 minut - Analyse af resultaterne, skal du bruge metoden foreslået for Livak og kolleger for at analysere qPCR data24. Brug enten Tubulin eller Actin som reference gener til at beregne ΔCt værdi og bruge det passende kontrol til at beregne den til ΔΔCt værdien for den specifikke gulne-inducerende behandling.
- Forberede primer-sæt af gener af interesse (50 µM primer).
- Protein udtryk og sekretion af IL6
- Frø 5 – 10 x 104 celler i mindst én godt af en 6-godt plade (5.2 – 10.5 x 103 celler/cm2) per tilstand indeholder 2 mL af D10. Behandlinger (hvis relevant) kan udføres direkte på denne plade, eller alternativt celler behandles allerede kan være re seedede i en 24-godt plade. Lad det stå natten over efter såning.
- Fjern mediet og erstatte til 2 mL af DMEM medium uden FBS. Inkuber i normale forhold i 24 timer.
- Indsamle medium i en 15 mL tube.
- Stikprøven på 300 x g der centrifugeres i 5 min. Medium kan opbevares ved-80 ° C indtil behandles.
- Følg fabrikantens instruktioner for at udføre ELISA.
- Sammenlign resultaterne af senescent celler versus den passende kontrol til specifikke gulne-inducerende behandling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Berigelse af SA-β-gal farvning i senescent fibroblaster
Β-galactosidase (β-gal) er en lysosomale enzym, der er udtrykt i alle celler, og som har en optimal pH 4,025,26. Dog under gulne, lysosomer stigning i størrelse, og derfor senescent celler ophobes β-gal. De øgede mængder af dette enzym gør det muligt at påvise dens aktivitet selv på en suboptimal pH 6.025,27. Figur 1A viser repræsentative billeder af SA-β-gal farvning i prolifererende versus senescent primære fibroblaster. Cellerne ser også udvidet og med en uregelmæssig cellen kroppen. Som nævnt, kan det være svært at skelne enkelte celler, så at en co farvning med DAPI letter visualisering og celle tælle (figur 1B). Det er nødvendigt at tage billeder i et fluorescens mikroskop at observere DAPI farvning. Dette betyder, at billeder på lysfelt kanal vil blive taget i sort/hvid, så "blå" farvning af SA-β-gal vises sorte på billederne. Bemærk er ikke alle celler i en stikprøve positive for β-gal. Effektiviteten af gulne induktion er stærkt afhængige af stimulus- og celle type/stamme anvendes. De protokoller er beskrevet her givet > 50% β-gal positive celler i primære fibroblaster (BJ og WI-38) i vores hænder.
Færre celler indarbejde EdU efter induktion af ældning
EdU er en analog af den nucleoside thymidine, der under aktiv DNA syntese, vil blive indarbejdet i DNA28. Indarbejdelse af EdU i DNA kan visualiseres efter udførelse af Copper-Catalyzed indeholder-alkyn cycloaddition (CuAAC) til EdU, reaktion, der ikke kan udføres i almindeligt thymidine, fordi det mangler alkyn gruppe28. I dette bestemt protokol, bliver et Sulfo-Cy3-indeholder brugt. Hvis kobling af indeholder til alkyn har fundet sted, vises celler fluorescens under et Cy3 filter (figur 2A). Det er vigtigt at tage i betragtning at udfører EdU indarbejdelse assay, celler, der skyder kan skelnes fra ikke-prolifererende celler. De ikke-prolifererende celler kan være enten inaktiv eller senescent, hvilket betyder, at EdU indarbejdelse assay ikke kan diskriminere mellem disse to typer af celle cyklus anholdelse.
Senescent fibroblaster upregulate CDK hæmmere p16 og p21
Senescent celler gøre brug af hæmmere af CDKs til at stoppe cellecyklus29. Især p16 og p21 måles ofte som markører for senescent celler3. Ene eller begge markører er normalt upregulated i senescent celler, og Opregulering måles ofte på transkriptionel niveau. Det anbefales at bruge begge markører samtidigt, da nogle celler ikke upregulate p16 på transkriptionel niveau og p21 er en universal men ikke specifikke markør for gulne15,17,30. Figur 3 viser repræsentative relative kvantificeringer af p16 og p21 mRNA i fibroblaster induceret til ældning. Andre teknikker såsom immunfarvning og/eller western blotting ægprodukters protein niveauer er også muligt.
Senescent fibroblaster vise en SASP
Mest senescent celler transcriptionally upregulate flere gener kodning udskilles proteiner, et fænomen kaldet SASP6. SASP omfatter faktorer involveret i inflammation, fx, interleukiner og kemokiner, eller i ekstracellulær matrix (ECM) nedbrydning, fx, MMPs, men det er meget heterogen. Induktion af SASP faktorer kan vurderes ved at måle enten mRNA udtryk niveauer via qPCR eller niveauer af udskilles protein via Enzyme-Linked Immuno sorptionsmiddel Assay (ELISA). Figur 4 viser et repræsentativt billede viser opregulering af IL6 på transkriptionel og udskilles. Vi brugte IL6 kun som en repræsentation; men det anbefales at måle flere medlemmer af SASP fra den foreslåede liste på protokollen 3.4.
Figur 1: berigelse af SA-β-gal farvning i senescent primære fibroblaster. BJ primære forhuden fibroblaster (PD 34.1) blev tilskyndet til at gulne ved at udsætte dem for ioniserende stråling (10 Gy). Celler var farvet for SA-βgal ti dage efter bestråling. (A) repræsentative resultater for SA-βgal farvning i BJ primære fibroblaster enten ubehandlet (op) eller udsat for ioniserende stråling (ned). Endelige forstørrelse: 100 X. (B) repræsentative figur af SA-β-gal Co farves med DAPI for BJ primære fibroblaster enten ubehandlet (tre venstre paneler) eller udsat for ioniserende stråling (tre rigtige paneler). DAPI farvning (blå) hjælper til at visualisere individuelle celler lette kvantificering. Billeder taget på lyse-feltet vises i sort/hvid. Derfor, i disse særlige billeder SA-β-gal farvning vil ligne sort perinuclear steder. Endelige forstørrelse: 100 X. (C) kvantificering af SA-β-gal positive celler i prolifererende (Prol., hvid) BJ fibroblaster versus ioniserende bestrålet-behandlede modparter (Sen., blå). Kvantificering blev udført ved hjælp af tre biologiske flergangsbestemmelser med fejllinjer viser standard fejlen af middelværdien. Statistisk signifikans var bestemt af en uparret tosidede Student's t-test på delta-CT værdier. (n = 3, ± SEM, *** = p -værdi < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: færre celler indarbejde EdU efter induktion af gulne. (A) repræsentativt billede af EdU indarbejdelse assay i prolifererende WI-38 fibroblaster PD 43.86 (venstre) og deres ioniserende bestrålede modparter (til højre). Endelige forstørrelse: 100 X. (B) kvantificering af EdU positive celler i prolifererende (Prol., hvid) BJ fibroblaster (PD 38,7) versus deres bestrålede modparter (Sen., blå). Kvantificering blev udført ved hjælp af tre biologiske flergangsbestemmelser med fejllinjer viser standard fejlen af middelværdien. Statistisk signifikans var bestemt af en uparret tosidede Student's t-test på delta-CT værdier (n = 3, ± SEM, *** = p -værdi < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Senescent fibroblaster upregulate CDK hæmmere p16 og p21. (A) kvantificering af p16 mRNA udtryk i prolifererende (Prol., hvid, PD 35,3) eller 5-aza-behandlede BJ celler (Sen., blå). (B) kvantificering af p21 mRNA udtryk i prolifererende (Prol., hvid, PD 35,3) eller 5-aza-behandlede BJ celler (Sen., blå). Kvantificering blev udført ved hjælp af tre biologiske flergangsbestemmelser (hver med to tekniske replikater) med fejllinjer viser standard fejlen af middelværdien. Statistisk signifikans var bestemt af en uparret tosidede Student's t-test på delta-CT værdier (n = 3, ± SEM, *** = p værdi < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Senescent fibroblaster vise en sekretoriske fænotype (SASP). (A) kvantificering af IL6 mRNA udtryk i BJ fibroblaster enten prolifererende (Prol., hvid, PD 38,7) eller induceret til ældning af ioniserende stråling (Sen., blå). (B) kvantificering af IL6 protein udtryk i prolifererende PD 38,6 (Prol., hvid) eller behandlet med ioniserende stråling WI38 fibroblaster (Sen., blå). Kvantificering blev udført ved hjælp af tre biologiske flergangsbestemmelser med fejllinjer viser standard fejlen af middelværdien. I tilfælde af qPCR data havde hver biologiske replikat to tekniske dubletter. Statistisk signifikans var bestemt af en uparret tosidede Student's t-test på delta-CT værdier (n = 3, ± SEM, *** =p -værdi < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Fortyndingsmiddel | Stamopløsningen | Brugsopløsning | Fortynding til behandling | Endelig koncentration | |
| SAHA | DMSO | 100 mM | 1 mM | 1:1,000 | 1 ΜM |
| Natrium butyrat | Sterilt vand | --- | 1 M | 1:250 | 4 mM |
| 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza) | DMSO | 100 mM | 10 mM | 1:1,000 | 10 ΜM |
Tabel 1: Materiel og arbejder løsninger til de forskellige behandlinger anvendes til Epigenetically-induceret ældning.
| Komponent | Volumen | Endelig koncentration |
| 20 mg/mL X-gal | 1 mL | 1 mg/mL |
| 0,2 M citronsyre/natrium fosfat buffer ph 6.0 | 4 mL | 40 mM |
| 100 mM kaliumferrocyanid | 1 mL | 5 mM |
| 100 mM kalium Ferricyanid | 1 mL | 5 mM |
| 5 M natriumchlorid | 0,6 mL | 150 mM |
| 1 M magnesiumchlorid | 0,04 mL | 2 mM |
| Vand | 12,4 mL | - |
| I alt | 20 mL |
Tabel 2: Sammensætning af farvning løsningen anvendes til gulne forbundet (SA) - β - gal farvning.
| Target | Videresende Primer (5' -> 3') | Vende Primer (5' -> 3') | UPL sonde | ||
| Tubulin | CTTCGTCTCCGCCATCAG | CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC | #40 | ||
| Aktin B | ccaaccgcgagaagatga | ccagaggcgtacagggatag | #64 | ||
| P16 | GAGCAGCATGGAGCCTTC | CGTAACTATTCGGTGCGTTG | #67 | ||
| P21 | tcactgtcttgtacccttgtgc | ggcgtttggagtggtagaaa | #32 | ||
| IL6 | CAGGAGCCCAGCTATGAACT | GAAGGCAGCAGGCAACAC | #45 | ||
| IL8 | GAGCACTCCATAAGGCACAAA | ATGGTTCCTTCCGGTGGT | #72 | ||
| IL1a | GGTTGAGTTTAAGCCAATCCA | TGCTGACCTAGGCTTGATGA | #6 | ||
| CXCL1 | CATCGAAAAGATGCTGAACAGT | ATAAGGGCAGGGCCTCCT | #83 | ||
| CXCL10 | GAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGT | GACATATACTCCATGTAGGGAAGTGA | #34 | ||
| CCL2 | AGTCTCTGCCGCCCTTCT | GTGACTGGGGCATTGATTG | #40 | ||
| CCL20 | GCTGCTTTGATGTCAGTGCT | GCAGTCAAAGTTGCTTGCTG | #39 | ||
| PAI1 | AAGGCACCTCTGAGAACTTCA | CCCAGGACTAGGCAGGTG | #19 | ||
| MMP1 | GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA | TTTGTGCGCATGTAGAATCTG | #7 | ||
| MMP3 | CCAGGTGTGGAGTTCCTGAT | CATCTTTTGGCAAATCTGGTG | #72 | ||
| MMP9 | GAACCAATCTCACCGACAGG | GCCACCCGAGTGTAACCATA | #53 | ||
Tabel 3: Primer sekvenser og deres tilsvarende UPL sonde til påvisning af mRNA gulne markører i prøver af menneskelig oprindelse.
| Komponent | Volumen/prøve |
| Sensifast Probe Lo-Rox mix | 5 ΜL |
| Primer-sæt (50 µM) | 0,1 ΜL |
| UPL sonde | 0,1 ΜL |
| Nukleasen-frit vand | 2.3 ΜL |
| cDNA (~ 4 ng) | 2,5 ΜL |
| I alt | 7.5 ΜL |
Tabel 4: Sammensætning af qPCR reaktionen mix for UPL system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollerne forklaret her var optimeret til menneskelige primære fibroblaster, især BJ og WI-38 celler. Protokollerne for replicative gulne, ioniserende stråling og doxorubicin, har været anvendt med succes til andre typer af fibroblaster (HCA2 og IMR90) og i andre celletyper (nemlig neonatal melanocytter og keratinocytter eller iPSC-afledte cardiomyocytes) i vores laboratorium. Dog kan tilpasninger for flere celletyper optimeres ved at justere nogle detaljer som antallet af seedede celler, metoder og kemikalier til at hjælpe celler til montering/afmontering til plast støtter og dosering af behandling for at undgå toksicitet.
Selv brugen af primære fibroblaster medfører en række udfordringer. Senescent celler er normalt sværere at frigøre end deres prolifererende kolleger, og de er ofte mere følsomme over for trypsinization eller enhver anden form for afmontering metode, hvilket betyder, at levedygtigheden efter afmontering er lidt lavere end den af prolifererende celler. Valget af den passende kontrol for de forskellige gulne-inducerende metoder er vanskeligt. For eksempel, for narkotika-baserede behandlinger såsom doxorubicin, foreslår vi en kort behandling med køretøjet: PBS for 24 h kontrolprøver for doxorubicin-behandlede celler efterfulgt af umiddelbar høst/behandling. Det kan hævdes, at celler inducerede at gulne gå gennem en udvidet kultur tid efter behandlingen blev anvendt (seks ekstra dage af kultur for doxorubicin-behandlede celler) og at kontrol celler bør være kulturperler lige lang tid efter fjernelse af PBS. Men sådan en lang kultur ville tillade cellerne til at opdele yderligere, at blive over sammenflydende eller til at kræve yderligere passaging og at øge PD. over sammenløbet kan forårsage gulne markører, såsom SA-β-gal vises trods celler opretholde deres prolifererende potentielle31. Den øgede PD ville få dem tættere til deres replikering grænse (og replicative gulne) og gøre dem mindre sammenlignes med deres doxorubicin-behandlede modstykker. En lignende situation ville gælde for de andre behandlinger. Vi har foreslået den kontrol, som vi finder mere passende for hver enkelt sag.
De fleste af de teknikker, der anvendes til at fremkalde celler i gulne synes relativt let og ligetil, men mange faktorer kan påvirke resultatet af forsøgene. For eksempel, er normal glukose koncentration af konventionel celle kultur medier for fibroblaster 4,5 g/L. Men for nogle celletyper såsom stamceller, lavere koncentrationer af glucose udvide deres proliferativ potentielle32, mens for andre højere koncentrationer kan føre til for tidlig ældning33. Desuden som senescent celler er stærkt metaboliske og bruger store mængder af energi at producere udskilles faktorer34, kan andre gulne-associerede fænotyper blive påvirket af svingninger i glucose koncentrationer.
En anden potentiel variabel i cellekulturmedium er serum. Sammensætningen af serum er normalt ikke defineret og varierer alt efter dyrenes kilden og partiet. Navnlig, kan beløbet af vækstfaktorer og pro-inflammatoriske proteiner påvirke gulne35. Vi anbefaler, at det samme parti af serum anvendes til hele forsøget for at undgå unødvendige og konfunderende variabilitet. Men nogle uundgåeligt tekniske betingelser såsom brugen af serumfrit medium bruges til nogle ELISA-baserede protokoller kan reducere SASP udtryk.
Ilt spændinger er vigtigt for komplet gulne induktion. Hypoxi kan hæmme geroconversion, således at celler ikke formere sig, men er ikke uigenkaldeligt anholdt36. Det mest almindelige problem i opsætningen af eksperimenterende er imidlertid ikke hypoxi men Iltforgiftning. Faktisk standard dyrkningsbetingelser bruger ofte 20% ilt som "normoxia", men fysiologiske betingelser for de fleste celletyper er lavere. Musen blastocyster præsentere markører for ældning (SA-βgal og DNA skader) når kulturperler på 20% ilt, i modsætning til deres i vivo-afledt modparter eller de samme celler dyrkes på 5% ilt37. Derudover kulturperler mus fibroblaster på flere fysiologiske tilstande (3% ilt) og ikke på konventionelle dem (20% ilt) display en SASP38. Her, vi brugte 5% ilt for alle kulturer og eksperimenter og vi opfordre forskere til at genoverveje ilt koncentrationerne anvendes til den særlige celletype af interesse.
Endelig er en anden faktor til at overveje den iboende heterogenitet af senescent celler. På den ene side vise forskellige celletyper og endda cellen stammer forskelle i gulne-associerede fænotyper. For eksempel, gør nogle stammer af fibroblaster ikke upregulate p16 på transkriptionel niveau på gulne induktion15,16,17, da det er også vist i figur 3A, hvor der til trods ser en opregulering af P16, dette var ikke statistisk signifikant. P16 er også kontrolleres på translationel og posttranslationelle, så måle protein niveauer kan i nogle tilfælde demonstrere en øget aktivitet af denne CDK hæmmer. Det kan imidlertid være, at nogle celler bare stole på andre CDK hæmmere som p21. Vi anbefaler måle de transkriptionel niveauer af dem begge. Den nøjagtige sammensætning af SASP afhænger også af den celle, der producerer det3. Desuden, nogle celler constitutively udtrykker høje niveauer af β-galactosidase, giver et positivt resultat for SA-β-gal farvning, ikke er nødvendigvis tegn på ældning3. I nogle tilfælde, kan dette problem overvindes ved at reducere inkubationstiden med Farvningsopløsningen under SA-β-gal farvnings-protokol. Som nævnt, kan overdreven sammenflydende celler også pletten med SA-β-gal uden dem er senescent31, så vi opfordrer forskere til kultur celler tyndt for at udføre denne farvning. På den anden side er gulne fænotype, selv ikke stabil39. Er tidsafhængig17,40, sammensætningen af SASP og udseende af andre markører for ældning. Her har vi foreslået tidspunkter efter hver behandling i hvilke celler der betragtes som fuldt senescent og at der rutinemæssigt bruges i vores laboratorium. Vigtigere, måtte måling af markører for en kortere tidspunkt være negativt resultat på grund af ufuldstændige gulne40. Desuden, da i de fleste af behandlingerne, en procentdel af cellerne ikke bliver senescent, kan ved hjælp af en længere tidspunkt kan give tilstrækkelig tid til de få ikke-senescent celler til at udvide og overhale kultur, at reducere udtryk af senescent markører. Udsigt over heterogenitet af senescent celler samt de flere forbehold i de forskellige markører opfordre vi stærkt forskere til at bruge flere gulne markører inden for samme prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NIELSEN
Acknowledgments
Vi takke medlemmerne af Demaria lab for frugtbare drøftelser, og Thijmen van Vliet til deling af data og protokollen vedrørende UV-induceret ældning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM Media - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
- Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
- Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
- Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
- Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
- Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
- Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
- Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
- Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
- Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
- Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
- Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
- Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
- Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
- Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
- Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
- Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
- Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
- Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).
