Nanomaterialen bieden veelzijdige mechanismen van gecontroleerde therapeutische aflevering voor zowel basiswetenschap en translationeel toepassingen, maar hun fabricage vaak vereist expertise die niet beschikbaar is in de meest biomedische laboratoria. Hier presenteren we protocollen voor het schaalbare fabricage en therapeutische laden van uiteenlopende zelf gemonteerd nanocarriers met behulp van flash nanoprecipitation.
Nanomaterialen presenteren een breed scala van opties voor het aanpassen van de gecontroleerde aflevering van enkelvoudige en gecombineerde moleculaire payloads voor therapeutische en imaging-toepassingen. Deze verhoogde specificiteit kan belangrijke klinische gevolgen, met inbegrip van verminderde bijwerkingen en lagere doseringen met hogere potentie hebben. Bovendien, de in situ richten en gecontroleerde modulatie van specifieke cel deelverzamelingen kunnen verbeteren in vitro en in vivo onderzoeken van elementaire biologische fenomenen en sonde functie cel. Helaas, de daarvoor vereiste deskundigheid in nanoschaal wetenschap, scheikunde en techniek vaak verbieden laboratoria zonder ervaring op deze terreinen fabriceren en aanpassen van nanomaterialen als hulpmiddelen voor hun onderzoek of voertuigen voor hun therapeutische strategieën. Wij bieden hier protocollen voor de synthese en schaalbare vergadering van een veelzijdige niet-toxisch copolymeer bloksysteem vatbaar voor de facile vorming en laden van nanoschaal voertuigen voor biomedische toepassingen. Flash nanoprecipitation wordt gepresenteerd als een methode voor het snelle fabricage van diverse nanocarriers van poly(ethylene glycol) –bl-poly (propyleen sulfide) copolymeren. Deze protocollen zal toestaan laboratoria met een breed scala van deskundigheid en middelen om gemakkelijk en reproducibly fabriceren geavanceerde nanocarrier levering systemen voor hun toepassingen. Het ontwerp en de bouw van een geautomatiseerd instrument die gebruikmaakt van een high-speed-spuitpomp ter vergemakkelijking van de flash nanoprecipitation verwerken en om verbeterde controle over de homogeniteit, grootte, morfologie en laden van polymersome nanocarriers is beschreven.
Nanocarriers toestaan voor de gecontroleerde aflevering van kleine en macromoleculaire lading, waaronder actieve entiteiten dat als niet ingekapseld, zou een zeer afbreekbaar en/of voor toediening in vivote hydrophobic. Van de nanocarrier morphologies regelmatig vervaardigd, bieden polymere blaasjes analoog aan liposomen (ook wel polymersomes genoemd) de mogelijkheid voor het gelijktijdig laden van hydrofiele en hydrofobe lading1,2. Ondanks hun veelbelovende voordelen zijn polymersomes nog steeds zeldzaam in klinische toepassingen, gedeeltelijk vanwege enkele cruciale uitdagingen goed opgepakt in hun productie. Voor klinisch gebruik moeten polymersome formuleringen plaatsvinden in grootschalige, steriel en consistente partijen.
Een aantal technieken kan worden gebruikt om de vorm polymersomes van een copolymeer van diblock, zoals poly(ethylene glycol) –blok-poly (propyleen sulfide) (PEG –bl– PPS), die bevatten oplosmiddelen dispersie3, dunne film rehydratie1 , 4, microfluidics 5,6en directe hydratatie7. Oplosmiddel dispersie omvat lange incubatie tijden in de aanwezigheid van organische oplosmiddelen, die kunnen sommige bioactieve payloads, zoals eiwitten denatureren. Dunne film rehydratie biedt geen controle over de polydispersiteit van het gevormde polymersomes, vaak duurder en tijdrovender extrusie technieken om aanvaardbare monodispersity vereist. Bovendien zijn zowel microfluids als directe hydratatie moeilijk te schaal voor grotere productievolumes. Van de verschillende nanocarrier fabricage methoden biedt flash nanoprecipitation (FNP) de mogelijkheid om grootschalige en reproduceerbare formuleringen8,9,10. Terwijl de FNP was eerder gereserveerd voor de formulering van solid-core nanodeeltjes, ons lab heeft onlangs uitgebreid het gebruik van de FNP te nemen van de consistente vorming van uiteenlopende PEG –bl– PPS nanostructuur morphologies11, 12, met inbegrip van polymersomes11 en bicontinuous nanospheres12. We vonden dat FNP kan vormen monodispers formuleringen van polymersomes zonder de noodzaak voor extrusie was, wat resulteert in superieure polydispersiteit indexwaarden in vergelijking met niet-geëxtrudeerde polymersomes gevormd door dunne film rehydratie en oplosmiddel dispersie 11. Bicontinuous nanospheres, met hun grote hydrofobe domeinen, konden niet worden gevormd door dunne film rehydratie, ondanks die onder een aantal oplosmiddel voorwaarden met FNP12.
Hier, wij bieden een gedetailleerde beschrijving voor de synthese van de PEG –bl– PPS diblock copolymeren gebruikt bij de vorming van de polymersome, de beperkte impingement jets (CIJ) mixer gebruikt voor FNP, de FNP protocol zelf, en de implementatie van een geautomatiseerd systeem te reduceren van variabiliteit van de gebruiker. Informatie over het steriliseren van het systeem om voldoende te produceren endotoxine-vrije formuleringen voor gebruik in vivoen representatieve gegevens over de karakterisering van polymersomes gevormd door de FNP is inbegrepen. Met deze informatie, zal lezers met belangstelling voor gebruik te maken van de polymersomes in vitro en in vivo arbeidsongeschiktheid zitten kundig voor fabriceren hun eigen steriele, monodispers-formuleringen. Lezers met ervaring in de formuleringen van de nanocarrier en met polymeer synthese expertise zal zitten kundig voor hun eigen polymeersystemen FNP gebruiken als een potentiële alternatief voor hun huidige formulering technieken snel te testen. Bovendien kunnen de hierin beschreven protocollen worden gebruikt als leermiddelen voor de formulering van de nanocarriers in nanotechnologie laboratorium cursussen.
Wij hebben verstrekt gedetailleerde instructies voor het snelle fabricage van polymersomes met behulp van PEG17–bl– PPS35-SH als de diblock-copolymeer. Vesiculaire polymersomes zijn de primaire statistische morfologie geassembleerd op deze verhouding van PEG hydrofiele en hydrofobe PPS blok molecuulgewicht. Wanneer meerdere keren Gemeenschapsverdrag, ze hebben een diameter en polydispersiteit die overeenkomt met polymersomes nadat hij door een 200 nm membraan geëxtrudeerd gevormd via</…
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen dat personeel en instrumentatie ondersteuning van de structurele biologie faciliteit aan de Northwestern University. De steun van de R.H. Lurie uitgebreide kanker centrum van Northwestern University en de Noordwestelijke Universiteit structurele biologie faciliteiten wordt erkend. De detector van de directe elektron Gatan K2 werd gekocht met middelen die door de Chicago biomedische Consortium met steun uit de fondsen Searle op The Chicago Gemeenschap Trust. Wij danken ook de volgende faciliteiten aan de Northwestern University: de Keck interdisciplinaire oppervlak wetenschap faciliteit, de structurele biologie-faciliteit, de biologische Imaging faciliteit, het Center for Advanced Molecular Imaging en de analytische Bionanotechnologie apparatuur Core. Dit onderzoek werd gesteund door de subsidie van de National Science Foundation 1453576, de nationale instituten van gezondheid directeur van nieuwe Innovator Award 1DP2HL132390-01, het centrum voor regeneratieve nanogeneeskunde katalysator Award en de 2014 McCormick katalysator Award. SDA werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH predoctoraal biotechnologie opleiding Grant T32GM008449.
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |