Schnelle, skalierbare Montage und Beladung von bioaktiven Proteinen und Immunstimulantien in diversen synthetischen darin über Flash-Nanoprecipitation
Summary
Nanomaterialien bieten vielseitige Mechanismen der kontrollierten therapeutischen Lieferung für Grundlagenforschung und Translationale Anwendungen, aber oft ihre Herstellung erfordert Fachwissen, das in den meisten biomedizinischen Labors nicht verfügbar ist. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für die skalierbare Fertigung und therapeutische laden diverse selbstgebaute darin, die Verwendung von Flash-Nanoprecipitation.
Abstract
Nanomaterialien präsentieren eine breite Palette von Optionen, um die kontrollierte Lieferung von Einzel- und kombinierte Molekulare Nutzlasten für therapeutische und imaging Anwendungen anzupassen. Diese erhöhte Spezifität kann signifikante klinische Implikationen, darunter geringere Nebenwirkungen und niedrigere Dosierungen mit höhere Potenz haben. Darüber hinaus können die Ausrichtung in Situ und kontrollierten Modulation von bestimmten Zelle Teilmengen verbessern in Vitro und in Vivo Untersuchungen der grundlegenden biologischen Phänomene und Sonde Zellfunktion. Leider das nötige Expertenwissen in der Nanotechnologie, Chemie und Technik oft verbieten Labors ohne Erfahrung in diesen Bereichen Herstellung und Anpassung von Nanomaterialien als Werkzeuge für ihre Untersuchungen oder Fahrzeuge für ihre therapeutische Strategien. Hier bieten wir Protokolle für die Synthese und skalierbare Montage eines vielseitigen ungiftig Block-Copolymer Systems zur oberflächlichen Bildung zugänglich und Laden von nanoskaligen Fahrzeuge für biomedizinische Anwendungen. Flash-Nanoprecipitation präsentiert sich als eine Methode zur schnellen Herstellung von vielfältigen darin aus Poly(ethylene glycol) –Bl-Poly (Propylen Sulfide) Copolymere. Diese Protokolle können Laboratorien mit einer breiten Palette von Kompetenzen und Ressourcen, um einfach und reproduzierbar fertigen fortschrittliche Nanocarrier-Delivery-Systeme für ihre Anwendungen. Planung und Bau von automatisierten Instrument, das eine High-Speed-Spritzenpumpe zur Erleichterung der Flash-Nanoprecipitation beschäftigt und um bessere Kontrolle über die Homogenität zu ermöglichen, Größe, Morphologie und Beladung des Polymersome darin ist beschrieben.
Introduction
Darin zu ermöglichen, für die kontrollierte Lieferung kleiner und makromolekularen Ladung, einschließlich aktive Einheiten, wenn nicht gekapselt, wäre entweder hoch abbaubar und/oder auch hydrophobe für Administration, in Vivo. Die Nanocarrier Morphologien regelmäßig fabriziert bieten Polymeren Vesikel analog zu Liposomen (auch Polymersomes genannt) die Möglichkeit, hydrophile und hydrophobe Cargo1,2gleichzeitig zu laden. Trotz ihrer vielversprechenden Vorteile sind Polymersomes immer noch selten in der klinischen Anwendung zurückzuführen, zum Teil auf mehrere wichtige Herausforderungen in ihren Fertigungsprozessen. Für den klinischen Einsatz Polymersome Formulierungen in großen, sterilen und konsistente Chargen vorgenommen werden müssen.
Eine Reihe von Techniken kann verwendet werden, um Form Polymersomes aus einer Diblock Copolymers, wie zum Beispiel Poly(ethylene glycol) –Block-Poly (Propylen Sulfide) (PEG –Bl– PPS), enthalten Lösungsmittel Dispersion3, Dünnschicht Rehydratation1 , 4, Mikrofluidik 5,6und direkte Hydratation7. Solvent Dispersion beinhaltet langen Inkubationszeiten in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, die einige bioaktiven Nutzlasten, wie Proteine denaturieren können. Dünnschicht-Rehydratation bietet keine Kontrolle über die Polydispersität von der gebildeten Polymersomes, häufig erfordert kostspielige und zeitraubende Extrusion Techniken, um akzeptable Monodispersity zu erreichen. Darüber hinaus sind sowohl die Mikroflüssigkeiten als auch die direkte Hydratation schwer zu skalieren für größere Produktionsmengen. Von den verschiedenen Nanocarrier Herstellungsmethoden bietet Flash-Nanoprecipitation (FNP) die Möglichkeit, umfassende und reproduzierbare Rezepturen8,9,10machen. Während FNP bisher für die Formulierung von Solid-Core Nanopartikel vorbehalten war, unser Labor hat vor kurzem erweitert den Einsatz von FNP sollen die konsequente Bildung von vielfältigen PEG –Bl– PPS Nanostruktur Morphologien11, 12, davon Polymersomes11 und Bicontinuous nanokugeln12. Wir fanden, dass FNP bilden Monodisperse Formulierungen von Polymersomes ohne die Notwendigkeit für Extrusion, was zu überlegen Polydispersität Index-Werte im Vergleich zu nicht extrudiert Polymersomes gebildet von Dünnschicht Rehydratation und Lösungsmittel dispersion 11. Bicontinuous nanokugeln mit ihrem großen hydrophoben Domänen konnten nicht von Dünnschicht Rehydratation, trotz bilden unter einer Reihe von Lösungsmittel Bedingungen mit FNP12gebildet werden.
Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung für die Synthese der PEG –Bl– PPS Diblock Copolymers verwendet in Polymersome-Formation, der engen Impingement Düsen (CIJ) Mischer verwendet für FNP, die FNP Protokoll selbst, und die Implementierung eines automatisierten Systems reduzieren Sie Benutzer Variabilität. Enthält Informationen darüber, wie das System ausreichend um Endotoxin-freie Formulierungen für den Einsatz in Vivound repräsentative Daten über die Charakterisierung von Polymersomes gebildet von FNP produzieren zu sterilisieren. Mit diesen Informationen werden die Leser mit Interesse an der Verwendung von Polymersomes für in Vitro und in Vivo -Arbeit in der Lage, ihre eigenen steril, Monodisperse Formulierungen zu fabrizieren. Leser mit Erfahrung in Nanocarrier Formulierungen und mit Polymer-Synthese-Expertise werden in der Lage, schnell eigene Polymersysteme mit FNP als eine mögliche Alternative zu ihren aktuellen Formulierung Techniken zu testen. Darüber hinaus können die hier beschriebenen Protokolle als Lehrmittel für die Formulierung von darin in Nanotechnologie Laborübungen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaillierte Anweisungen für die schnelle Herstellung von Polymersomes mit PEG17–Bl– PPS35-SH als Diblock Copolymers. Vesikuläre Polymersomes sind die primären aggregierte Morphologie bei diesem Verhältnis von PEG hydrophile und hydrophobe PPS Block Molekulargewicht montiert. Wenn mehrere Male ausgewirkt, sie haben einen Durchmesser und Polydispersität, die Polymersomes, nachdem er durch eine 200 nm Membran extrudiert entspricht gebildet über Dünnschicht-Hydratation. Dieses …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir anerkennen, dass Mitarbeiter und Instrumentierung von der strukturellen Biologie-Anlage an der Northwestern University zu unterstützen. Die Unterstützung von R.H. Lurie umfassende Cancer Center der Northwestern University und der Northwestern University strukturelle Biologie Einrichtungen wird anerkannt. Gatan K2 direkte Elektron Detektors wurde mit Mitteln der Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust erworben. Wir danken auch folgenden Einrichtungen an der Northwestern University: Keck interdisziplinäre Oberfläche wissenschaftlichen Einrichtung, die strukturelle Biologie-Anlage der biologischen Imaging Facility, das Center for Advanced Molekulare Bildgebung und die analytische Bionanotechnologie Ausrüstung Kern. Diese Forschung wurde von der National Science Foundation Grant 1453576, der nationale Institute der Gesundheit Direktor neue Innovator Award 1DP2HL132390-01, das Zentrum für Regenerative Nanomedizin Catalyst Award und 2014 McCormick Catalyst Award unterstützt. SDA wurde teilweise von NIH predoctoral Biotechnologie Ausbildung Grant T32GM008449 unterstützt.
Materials
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
Riferimenti
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