Nanomaterial tillhandahålla mångsidiga mekanismer av kontrollerad terapeutiska leverans för både grundforskning och translationell applikationer, men deras tillverkning ofta kräver expertis som är tillgänglig i de flesta biomedicinska laboratorier. Här presenterar vi protokoll för skalbara fabrication och terapeutiska lastning av olika själv monterade nanocarriers använder flash nanoprecipitation.
Nanomaterial presenterar ett brett utbud av alternativ för att anpassa den kontrollerade leveransen av enkel- och kombinerade molekylär nyttolaster för terapeutiska och tänkbar program. Detta ökade specificitet kan ha betydande kliniska konsekvenser, inklusive minskade biverkningar och lägre doser med högre potens. Dessutom kan den i situ inriktning och kontrollerade modulering av viss cell undergrupper förbättra in vitro och i vivo utredningar av grundläggande biologiska fenomen och sond cellernas funktion. Tyvärr, den erforderliga sakkunskapen i nanoskala naturvetenskap, kemi och teknik ofta förbjuder laboratorier utan erfarenhet i dessa fält tillverka och anpassa nanomaterial som verktyg för sina undersökningar eller fordon för deras terapeutiska strategier. Här tillhandahåller vi protokoll för syntes och skalbar montering av en mångsidig giftfri block sampolymer system mottagliga för facile bildandet och lastning av nanoskala fordon för biomedicinska tillämpningar. Flash nanoprecipitation presenteras som en metod för snabb tillverkning av olika nanocarriers från poly(ethylene glycol) –bl-poly (propylen svavelväte) sampolymerer. Dessa protokoll kommer tillåta laboratorier med ett brett utbud av expertis och resurser för att lätt och reproducibly tillverka avancerade nanocarrier leveranssystem för sina program. Design och konstruktion av ett automatiserade instrument som sysselsätter en höghastighets sprutpumpen att underlätta den flash nanoprecipitation bearbeta och för att möjliggöra förbättrad kontroll över homogenitet, storlek, morfologi och lastning av polymersome nanocarriers är beskrivs.
Nanocarriers möjliggör den kontrollerade leveransen av små och makromolekylär Last, inklusive aktiva entiteter som, om inte inkapslad, skulle vara antingen mycket nedbrytbara eller alltför hydrofoba för administration i vivo. Av de nanocarrier morfologier regelbundet fabricerade, erbjuder polymera blåsor analogt med liposomer (även kallad polymersomes) möjligheten att samtidigt Ladda hydrofil och hydrofoba Last1,2. Trots deras lovande fördelar är polymersomes fortfarande sällsynt i kliniska tillämpningar, delvis flera viktiga utmaningar i sin tillverkning. För klinisk användning behöver polymersome formuleringar göras i storskaliga, steril och konsekvent partier.
Ett antal tekniker kan användas för att bilda polymersomes från en diblock sampolymer, såsom poly(ethylene glycol) –block-poly (propylen svavelväte) (PEG –bl– PPS), som inkluderar solvent dispersion3, tunn film rehydrering1 , 4, mikrofluidik 5,6och direkt återfuktning7. Solvent dispersion innebär långa inkubationstider i närvaro av organiska lösningsmedel, som kan denaturera vissa bioaktiva nyttolaster, som proteiner. Tunn film rehydrering erbjuder inte kontroll över polydispertion av den bildade polymersomes, som ofta kräver dyra och tidskrävande extrudering tekniker för att uppnå acceptabel monodispersity. Dessutom är både microfluids och direkt återfuktning svåra att skala upp för större produktionsvolymer. Av olika nanocarrier fabrication metoder erbjuder flash nanoprecipitation (FNP) möjligheten att göra storskaliga och reproducerbara formuleringar8,9,10. Medan FNP var tidigare reserverat för formulering av solid-core nanopartiklar, vårt labb har nyligen expanderat användningen av FNP att inkludera konsekvent bildandet av olika PEG –bl– PPS nanostruktur morfologier11, 12, inklusive polymersomes11 och bicontinuous nanospheres12. Vi fann att FNP var kan bilda monodisperse formuleringar av polymersomes utan behov av extrudering, vilket resulterar i överlägsen polydispertion indexvärden jämfört med icke-extruderade polymersomes bildas av tunn film rehydrering och solvent dispersion 11. Bicontinuous nanospheres, med sin stora hydrofoba domäner, har inte kunnat bildas av tunn film rehydrering, trots bildar under ett antal lösningsmedel villkor med FNP12.
Här ger vi en detaljerad beskrivning för syntesen av PEG –bl– PPS diblock sampolymer används i polymersome formation, trånga impingement jets (CIJ) mixern används för FNP, FNP protokoll själv, och genomförandet av ett automatiserat system för att minska användaren variabilitet. Här ingår information om hur du sterilisera systemet tillräckligt för att producera endotoxinfria formuleringar för användning i vivooch representativa uppgifter om karakterisering av polymersomes bildas av FNP. Med denna information, kommer läsare med intresse i att utnyttja polymersomes för in vitro- och in-vivo arbete att kunna tillverka egna sterila, monodisperse formuleringar. Läsare med erfarenhet i nanocarrier formuleringar och med polymer syntes expertis kommer att kunna snabbt testa egna polymera system använder FNP som en potentiella alternativ till sin nuvarande formulering-tekniker. De protokoll som beskrivs häri kan dessutom användas som pedagogiska verktyg för utformningen av nanocarriers i nanoteknik laboratorium kurser.
Vi har gett detaljerade instruktioner för snabb tillverkning av polymersomes med PEG17–bl– PPS35-SH som den diblock sampolymer. Vesikulär polymersomes är den primära sammanlagda morfologi monteras på detta förhållande hydrofil PEG och hydrofoba PPS block molekylvikt. När träffas flera gånger, de har en diameter och polydispertion som matchar polymersomes extruderade genom en 200 nm membran efter att ha bildat via tunn film återfuktning. Detta protokoll eliminerar därmed…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner att personalen och instrumentation stöd från strukturell biologi anläggningen vid Northwestern University. Stödet från det R.H. Lurie omfattande Cancer Center av Northwestern universitetet och Northwestern University strukturell biologi faciliteter är erkänt. Gatan K2 direkt elektron detektorn köptes med medel från Chicago biomedicinsk konsortiet med stöd från Searle fonderna på The Chicago Community Trust. Vi tackar också följande faciliteter vid Northwestern University: anläggningen Keck tvärvetenskapliga yta-vetenskap, strukturell biologi anläggningen, biologiska Imaging anläggningen, Center for Advanced Molecular Imaging och analytiskt Bionanoteknik utrustning Core. Denna forskning stöddes av National Science Foundation bidraget 1453576, nationella institut för hälsa direktörens nya innovatör Award 1DP2HL132390-01, Center for regenerativ nanomedicin katalysator Award och 2014 McCormick katalysator Award. SDA stöddes delvis av NIH pre bioteknik utbildning Grant T32GM008449.
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |