Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.
Abstract
Die epigenetische Transkription Verordnung vermittelt durch 5-Methylcytosine (5mC) hat in eukaryotischen Entwicklung eine entscheidende Rolle gespielt. Demethylierung dieser epigenetischen Markierungen geschieht durch sequentielle Oxidation durch zehn-elf Translokation Dioxygenases (TET1-3), gefolgt von Thymin-DNA-Glycosylase-abhängige base Excision Repair. Inaktivierung des Gens TET2 aufgrund von genetischen Mutationen oder durch andere epigenetischen Mechanismen ist verbunden mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten, vor allem hämatopoetischen Malignome. Hier beschreiben wir eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des enzymatisch aktive unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase mit KATIONENAUSTAUSCH-Chromatographie. Weiter bieten wir einen flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Ansatz, der trennen und die vier normale DNA-Basen (A, T, G und C), sowie die vier modifizierte Cytosin-Basen (5-Methyl, 5-Hydroxymethyl, 5-Formyl und 5-Carboxylgruppen) zu quantifizieren. Dieser Test kann verwendet werden, um die Aktivität der Wildtyp und Mutanten TET2 Dioxygenases zu bewerten.
Introduction
Die C5-Position von Cytosin-Basen innerhalb von CpG dinucleotid ist die vorherrschende Methylierung-Website (5mCpG) in Säugetier-Genome1. Eine Reihe neuerer Studien haben darüber hinaus umfangreiche C5 Cytosin Methylierung (5mC) in nicht-CpG Websites entdeckt (5mCpH, wo H = A, T, oder C)2,3. 5mC Änderung dient als transkriptioneller Schalldämpfer bei endogenen Retrotransposons und Gen Promotoren3,4,5. DNA-Methylierung bei 5mC spielt auch eine wichtige Rolle im x-Chromosom Inaktivierung, gen Prägung, nukleare Neuprogrammierung und gewebespezifische Gen Ausdruck5,6,7. Methylierung von Cytosin an der C5-Position erfolgt durch DNA-Methyltransferasen und Mutationen in diesen Enzymen verursachen erhebliche Entwicklungsschäden8. Die Entfernung von 5mC Marken werden von TET1-3 5mC oxidasen9,10initiiert. Diese Dioxygenases TET-Familie wandeln 5mC in 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-FU) und 5-Carboxylcytosine (5caC) durch sequentielle Oxidation Schritte11,12,13. Schließlich ersetzt Thymin-DNA-Glycosylase 5fC oder 5caC zu unveränderten Cytosin mit base Excision Repair Weg11.
Das menschliche Gen TET2 wurde als ein häufig mutierte Gen in vielfältigen hämatopoetischen Malignome einschließlich myelodysplastischen Syndromen (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative Neoplasmen (identifiziert. MDS-MPN), und akute myeloische Leukämie (AML) aus MDS und MDS-MPN16. Die Höhe der 5hmC Änderung im Knochenmark DNA sind niedriger bei Patienten mit TET2 Mutationen im Vergleich zu denen mit Wildtyp (wt)-TET214. Eine Anzahl von Gruppen entwickelten TET2-Knockout-Maus-Modellen um ihre Rolle bei der normalen Hämatopoese und myeloischer Transformation17,18,19,20zu erhellen. Diese Mäuse mit Mutationen im TET2-gen wurden zunächst normal und lebensfähig, aber vielfältige hämatopoetischen Malignome manifestiert, als sie im Alter von ihrem frühen Tod verursacht. Diese Studien zeigten die wichtige Rolle der wt-TET2 in normaler Hämatopoetischer Differenzierung. Diese Maus-Modellen, die heterozygot Hämatopoetischen Stammzellen (TET2+ / HSCs) und homozygot TET2– / – hatte HSCs einen Wettbewerbsvorteil gegenüber homozygot wt-TET2 HSCs in repopulating hämatopoetische Linien als beide TET2+ /- und TET2– / – Hsz entwickelt vielfältige hämatopoetischen Malignome17,18. Diese Studien zeigen, dass Haploinsufficiency von TET2 Dioxygenase verändert die Entwicklung von Hsz und hämatopoetische Tumoren führt.
Ähnlich wie Mäuse mit Mutationen im TET2-gen, die meisten Leukämie-Patienten manifestieren Haploinsufficiency TET2 Dioxygenase Aktivität. Diese meist heterozygoten somatischen Mutationen sind Frame-Shift und Unsinn Mutationen, die verstreut im ganzen TET2 gen Körper während Missense-Mutationen, die meisten sind gruppiert in der Dioxygenase Domäne12. Bisher ist wenig Charakterisierung des wt und Mutant-TET2 in der Literatur vor allem aufgrund von Schwierigkeiten mit der Produktion von TET2-Dioxygenase und seine Assay21beschrieben. Hier berichten wir über einer einfachen einstufigen Läuterung der native TET2 Dioxygenase mit Ionenaustausch-Chromatographie. Darüber hinaus wurde eine quantitative LC-MS/MS-Assay optimiert und verwendet, um die enzymatische Aktivität von native TET2 Dioxygenase messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutationen im TET2-gen sind einige der am häufigsten gefundenen genetischen Veränderungen bei Patienten mit unterschiedlichen hämatopoetischen Malignome. Bis heute hunderte von verschiedenen TET2 Mutationen, darunter Unsinn, Frame-Shift und Missense-Mutationen wurden in Patienten12identifiziert. Patienten mit TET2 Mutationen zeigen niedrige Konzentrationen von genomischen 5hmC im Knochenmark, im Vergleich zu denen mit wt-TET214. Mutierte TET2 Knock-in E…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde finanziert durch das US Department of Defense in Form eines Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastischer Anämie & MDS Foundation Grant, und UMRB Grant, M.M. Authors Danke Mohit Jaiswal und Subhradeep Bhar für erste Klonen von TET2 in pDEST14 Vektor.
Materials
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Riferimenti
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