والرزن سريع فوعة جرثومية المستندة إلى الصور استخدام أميبا
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لقياس ضراوة البكتيريا العوالق أو المرفقة بالسطح باستخدام ديسكويديوم دال (الاميبا) كمضيف. فوعة يقاس مدى ح 1 والمضيف مما أسفر عن مصرع هو كمياً باستخدام التحليل المجهري والصورة الفلورية. علينا أن نظهر هذا البروتوكول باستخدام بكتيريا P. الزّنجاريّة.
Abstract
فحوصات الفوعة الجرثومية التقليدية تنطوي على التعرض لفترة طويلة للبكتيريا على مدى عدة ساعات للخلايا المضيفة. وخلال هذا الوقت، يمكن أن البكتيريا تغيرات في الفسيولوجيا بسبب التعرض لبيئة النمو المضيف ووجود خلايا المضيف. لقد طورنا فحص لقياس سرعة حالة ضراوة من البكتيريا التي تقلل من مدى التي تنمو فيها البكتيريا حضور الخلايا المضيفة. البكتيريا الزحارية مختلطة معا ومعطلة على متن طائرة واحدة تصوير باستخدام جهاز pad أجار. يستخدم الإجراء تصوير fluorescence خلية واحدة مع إستر كالسين-أسيتوكسيميثيل (كالسين-ص) كمؤشر على صحة الخلية المضيفة. ويتم تحليل الأسفار الخلايا المضيفة بعد ح 1 من التعرض للخلايا المضيفة للبكتيريا باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي. صورة تحليل البرمجيات المستخدمة لحساب مؤشر قتل مضيف. وقد استخدمت هذا الأسلوب لقياس ضراوة داخل العوالق والمرفقة بالسطحية الزائفة الزّنجاريّة السكان الفرعية خلال المرحلة الأولى من تشكيل بيوفيلم ويمكن تكييفها للبكتيريا الأخرى والمراحل الأخرى من النمو بيوفيلم. هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة وقوية من قياس ضراوة ويتجنب العديد من التعقيدات المرتبطة بالنمو والحفاظ على خطوط خلايا الثدييات. تعمل الفوعة تقاس هنا باستخدام الزحارية قد صودق باستخدام الماوس الضامة. على وجه الخصوص، هذا التحليل كانت تستخدم لإنشاء ذلك فوعة أوبريجولاتيس مرفق السطحية P. الزّنجاريّة.
Introduction
العدوى البكتيرية واحدة من الأسباب الرئيسية للوفيات في الإنسان والحيوانات1،2. القدرة على قياس ضراوة البكتيريا في ثقافات أو الأغشية الحيوية مهم في إعدادات الرعاية الصحية والبحوث. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنوعاً وسريعة وبسيطة نسبيا لقياس الفوعة الجرثومية. وتستخدم الكائنات الحية حقيقية النواة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم (الاميبا) كنموذج الكائن المضيف. دال-ديسكويديوم قد استخدمت كمضيف لتحديد عوامل الفوعة في الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة)3،،من45 والأخرى البكتيريا6،7 ،8 وهو عرضه لالي حد كبير عوامل الفوعة ذاتها التي تقتل خلايا الثدييات بما في ذلك النوع الثالث إفراز9،10. وأشركت فحوصات الفوعة السابقة باستخدام ديسكويديوم دال- التعرض المطول للبكتيريا مع الخلايا ديسكويديوم دال- على مدى ساعات3،،من45. ويقدم البروتوكول، هنا، طريقة سريعة لتحديد ضراوة استخدام هذا الاميبا. هذا البروتوكول (الشكل 1) ويصف كيفية: (1) تنمو الزحارية أكسينيكالي (في عدم وجود البكتيريا)، (2) تنمو البكتيريا للمقايسة، (3) إعداد البكتيريا والخلايا المضيفة للفحص المجهري، (4) إجراء الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي، و (5) تحليل أميبا الأسفار.
في البداية الزحارية السنة اللهب أثناء الخروج من الأرصدة المجمدة وتزرع في حديقة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)، حيث تنتج الزحارية الجراثيم. التقطت هذه الجراثيم وتلقيح إلى وسيلة إثراء لنمو أكسينيك. يتم الاحتفاظ في الزحارية من خلال النمو أكسينيك في ظروف الغنية بالمغذيات حتى أنهم على استعداد لتكون مختلطة مع البكتيريا لتقييم الفوعة الجرثومية. البقاء أو موت الزحارية هو كمياً عن طريق قياس الأسفار من كالسين-أسيتوكسيميثيل (كالسين-ص)، وهو المشقوق من استيراسيس داخل الخلايا، وبالتالي تنشيط للأسفار11،12. الزحارية لايف يحمل الأسفار القليل أو لا بينما أكد وخلايا الموت فلوريس مكثف. هذه النتيجة بسبب إدراج قليلاً أو لا كالسين-صباحا إلى الزحارية صحية والتأسيس والانقسام من الركازة في الزحارية أكد13. يعتبر هذا السلوك خاصة متميزة من الأسفار كالسين-صباحا في خلايا الثدييات11،14،،من1516.
وتزرع البكتيريا التي سيجري تقييم لضراوة كل على حدة. هنا، نحن تصف كيفية قياس ضراوة من مسببات الأمراض الانتهازية الزّنجاريّة P. وتفاصيل كيفية تحديدها كمياً ضراوة من العوالق (سباحة) والسكان الفرعية المرفقة بالسطح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لاختبار ضراوة البكتيريا الأخرى. في مقطع النتائج الممثل، نظهر أن ضراوة تنشيط في الخلايا المرفقة بالسطح ومنخفضة في الخلايا العوالق، التي ذكرت سابقا13. تنشيط الفوعة المرفقة بسطح P. الزّنجاريّة يقتل الزحارية بينما الخلايا العوالق غير الخبيثة يتم استهلاكها بواسطة الزحارية. إذا كان هو فقط يجري جزيئي ضراوة البكتيريا العوالق، يمكن أن تكون البكتيريا المستزرعة في أنابيب الثقافة عادية بدلاً من استخدام أطباق بيتري كما هو مبين في البروتوكول.
يجب أن يكون نمو الزحارية والثقافات P. الزّنجاريّة منسقة مثل الثقافات P. الزّنجاريّة التوصل إلى مرحلة النمو المقصود في حين تتزايد الزحارية في حالة مستقرة في ظروف الغنية بالمغذيات. ويتطلب هذا الشرط عادة الثقافات الزحارية أن تضعف قبل 1 يوم على الأقل عندما كانت مختلطة مع البكتيريا. الزحارية والبكتيريا هي معطلة باستخدام منصات أجار، وهي شاركت المحتضنة ح 1، وتصويرها باستخدام دقة منخفضة (10 X، الفتحة العددية 0.3) بتصفية البروتينات الفلورية الخضراء، وموضوعية (التجارة والنقل)، وكاميرا تصوير. تحليل يمكن أن يؤديها باستخدام برمجيات ImageJ متاحة بحرية، أو تخصيص برنامج تحليل الصور. تم إجراء تحليلنا باستخدام البرمجيات الخاصة بنا مكتوبة باستخدام حزمة تحليل علمي13. ينبغي إنشاء قناع باستخدام الصورة التباين المرحلة البرنامج واستخراج القيم الأسفار من مجالات الملثمين في الصورة الفلورية. يتم حساب متوسط القيم الأسفار عبر خلايا على الأقل 100، أسفر عن مؤشر قتل مضيف عددي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول وصف أسلوب سريع والكمية الاعتداء الفوعة في P. الزّنجاريّة. ويمكن اختبار هذا البروتوكول مع البكتيريا الأخرى. ومع ذلك، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن متوسط النمو ينبغي أن تكون متوافقة مع ظروف النمو أميبا. على وجه الخصوص، نحن الأمثل البروتوكول باستخدام PS:DB كوسيلة النمو الج…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP وكما كتب وتنقيح هذه المخطوطة. KP إجراء التجارب والتحليل. وأيده هذا العمل على “جائزة الانتقال الوظيفي المعاهد الوطنية للصحة” (NIH) (K22AI112816) إلى as.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
Riferimenti
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O’Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
