아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과
Summary
여기, 선물이 D. discoideum (아메바)를 사용 하 여 호스트 planktonic 또는 표면에 부착 된 세균의 독성을 측정 하는 프로토콜. 독성은 1 시간 동안 측정 하 고 호스트를 죽이 형광 현미경 검사 법 및 이미지 분석을 사용 하 여 계량. 이 프로토콜 P. 농 균박테리아를 사용 하 여 설명 합니다.
Abstract
전통적인 세균 독성 분석 실험 호스트 셀에 몇 시간에 걸쳐 박테리아의 장기간된 노출을 포함 됩니다. 이 기간 동안 박테리아 호스트 성장 환경에 노출 하 고 호스트 세포의 존재로 인해 생리에 변화를 받을 수 있습니다. 우리는 빠르게는 박테리아 호스트 세포의 성장 정도 최소화 하는 박테리아의 독성 상태를 측정 하는 분석 결과 개발. 박테리아와 amoebae 함께 혼합 하 고 천 패드를 사용 하 여 단일 영상 평면에 움직일 수 있다. 절차는 호스트 세포 건강의 지표로 서 에스테 르 calcein acetoxymethyl (calcein-오전) 단일 셀 형광 이미징을 사용합니다. 호스트 세포의 형광 박테리아 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 호스트 세포의 노출의 1 시간 후 분석 된다. 이미지 분석 소프트웨어는 호스트 살인 인덱스를 계산 하는 데 사용 됩니다. 이 방법은 planktonic 및 표면 부착 녹 농 균 에서 독성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다 biofilm 형성의 초기 단계에서 하위 인구 및 다른 박테리아와 biofilm 성장의 다른 단계에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜 독성을 측정 하는 신속 하 고 강력한 방법을 제공 합니다 그리고 많은 성장과 포유류 세포의 유지 보수와 관련 된 복잡성을 방지 합니다. 여기 amoebae를 사용 하 여 측정 하는 독성 고기 또한 마우스 대 식 세포를 사용 하 여 확인 되었습니다. 특히,이 분석 결과 피 녹 농 균에 그 표면 첨부 파일 upregulates 독성 설정 하 사용 되었다.
Introduction
세균 감염 인간과 동물1,2사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 문화 또는 biofilms에 박테리아의 독성을 측정 하는 능력은 의료 및 연구 설정에 중요 합니다. 여기, 세균성 독성을 계량 하는 다재 다능 한, 빠른, 그리고 상대적으로 간단한 방법을 설명 합니다. 진 핵 유기 체 Dictyostelium discoideum (아메바) 모델 호스트 유기 체로 사용 됩니다. D. discoideum 은 녹 농 균 (P. 녹 농 균)3,,45 에 다른 박테리아6,7 독성 요소를 식별 하는 호스트로 사용 되었습니다. ,8 주로 같은 독성 요인 유형 III 분 비9,10을 포함 한 포유류 세포를 죽이 게 쉽습니다. D. discoideum 를 사용 하 여 이전 독성 분석 실험 시간3,,45의 과정을 통해 디 discoideum 세포를 가진 박테리아의 장기간된 노출을 관련 있다. 프로토콜, 여기,이 아메바를 사용 하 여 독성을 결정 하는 빠른 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜 (그림 1) 설명 하는 방법: (1) axenically (에서 박테리아의 부재) amoebae 성장, (2) 분석 결과 대 한 박테리아, (3) 준비 박테리아 성장과 현미경 검사 법, (4)에 대 한 호스트 셀 epifluorescence 현미경 검사 법, 수행 하 고 (5) 아메바 분석 형광입니다.
Amoebae 처음 냉동된 주식에서 줄무늬 고는 amoebae 포자를 생산 하는 곳의 대장균 (대장균), 잔디밭에 성장. 이 포자는 포착 하 고 axenic 성장 위한 풍부한 매체에 주사. amoebae는 영양분이 풍부한 조건에서 axenic 성장을 통해 세균 독성의 평가 대 한 박테리아와 혼합 될 준비가 될 때까지 유지 됩니다. 생존 또는 amoebae의 죽음은 calcein-acetoxymethyl (calcein-오전), 세포내 esterases에 의해 죽 습 이며, 따라서, 형광11,12에 대 한 활성화의 형광을 측정 하 여 정량. 강조 하는 반면 라이브 amoebae 거의 비슷하게 형광을 전시 하 고 죽어가는 세포 형광 강렬 하지. 이 결과 calcein-오전 건강 amoebae와 법인의 조금 또는 전혀 설립 및 스트레스 amoebae13기판의 분열. 이 문제는 특히 포유류 세포11,,1415,16calcein 오전 형광 다릅니다.
박테리아 독성에 대 한 평가 별도로 성장 된다. 여기, 우리는 기회 주의 병원 체 피 녹 농 균 의 독성을 측정 planktonic (수영) 및 표면 부착 부분 모집단의 독성을 계량 하는 방법에 자세히 설명 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아의 독성 테스트를 적용할 수 있습니다. 대표적인 결과 섹션에서 우리는 독성 표면 부착 세포에서 활성화 되 고 보여줄 낮은 planktonic 셀에 이전13보고 했다. 비 악성 planktonic 세포는 amoebae 소비 하는 동안 표면에 부착 된 독성 활성화 P. 농 균 amoebae 죽인다. Planktonic 박테리아의 독성은 전적으로 분석 되 고, 박테리아는 프로토콜에 설명 된 대로 접시를 사용 하는 것 보다는 일반 문화 관에서 경작 될 수 있습니다.
P. 농 균 문화는 amoebae 영양분이 풍부한 조건에서 안정 된 상태에서 성장 하는 동안 의도 성장 단계에 도달 되도록 amoebae의 P. 농 균 문화 성장 조정 해야 합니다. 이 상태는 일반적으로 그들은 박테리아와 혼합 되어 적어도 1 일 하기 전에 희석 amoebae 문화를 필요 합니다. Amoebae 및 박테리아 천 패드를 사용 하 여 움직일 수는, 1 시간에 대 한 공동 incubated 이며 객관적인, 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터, 낮은 해상도 (10 X, 숫자 조리개 0.3)와 이미징 카메라를 사용 하 여 몇 군데. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용자 정의. 우리의 분석은 과학적인 분석 패키지13를 사용 하 여 작성 하는 우리 자신의 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 소프트웨어 단계 명암 이미지를 사용 하 여 마스크를 만들고 형광 이미지의 마스크 된 영역에서 형광 값을 추출 해야 합니다. 형광 값은 적어도 100 셀, 숫자 호스트 살인 색인 결과 이상 평균 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 P. 녹 농 균에 독성 분석 결과를 신속 하 고 양적 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아와 테스트할 수 있습니다. 그러나, 그것은 성장 매체 아메바 성장 조건와 호환 되어야 하는 마음에 유지 하는 것이 중요입니다. 특히, 우리는 세균성 성장 매체로 PS:DB를 사용 하 여 프로토콜을 최적화 했습니다. 다른 미디어를 사용 하는 경우에는 셀이 없으면 세균성 매체는 amoebae…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP와 그대로 쓴 원고를 수정. KP는 실험 및 분석을 수행합니다. 이 작품을 다른 이름으로 국립 보건원 (NIH) 경력 전환 상 (K22AI112816)에 의해 지원 되었다
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
Riferimenti
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