Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per misurare la virulenza dei batteri planctonici o collegata alla superficie mediante d. discoideum (ameba) come un ospite. Virulenza viene misurato su un periodo di 1 h e host uccidendo è quantificata mediante analisi di immagine e microscopia di fluorescenza. Dimostriamo questo protocollo utilizzando il batterio p. aeruginosa.
Abstract
Saggi di virulenza batterica tradizionale coinvolgono l’esposizione prolungata dei batteri nel corso di diverse ore per le celle. Durante questo periodo, i batteri possono subire cambiamenti nella fisiologia a causa dell’esposizione all’ambiente di crescita di host e la presenza di cellule dell’ospite. Abbiamo sviluppato un test per misurare rapidamente lo stato di virulenza dei batteri che riducono al minimo l’entità a cui i batteri crescono in presenza di cellule dell’ospite. Batteri e amebe sono mescolate insieme e immobilizzate su un unico piano di formazione immagine usando un tampone di agar. La procedura utilizza l’imaging di fluorescenza di cella singola con calceina-acetossimetil estere (calceina-AM) come indicatore di salute della cellula ospite. La fluorescenza delle cellule dell’ospite viene analizzata dopo 1 h di esposizione delle cellule dell’ospite ai batteri utilizzando epifluorescenza. Software di analisi di immagine viene utilizzato per calcolare un indice di abbattimento di host. Questo metodo è stato utilizzato per misurare la virulenza all’interno planctonici e collegata alla superficie Pseudomonas aeruginosa sottopopolazioni durante la fase iniziale di formazione del biofilm e può essere adattato ad altri batteri e altre fasi di crescita di biofilm. Questo protocollo fornisce un metodo rapido e robusto di virulenza di misura ed evita molte delle complessità associati alla crescita e la manutenzione di linee cellulari di mammifero. Fenotipi di virulenza qui misurati utilizzando le amebe sono stati convalidati anche utilizzando i macrofagi del topo. In particolare, questa analisi è stata usata per stabilire tale virulenza sopraregola collegamento di superficie in p. aeruginosa.
Introduction
Infezione batterica è una delle principali cause di mortalità in umani e animali1,2. La capacità di misurare la virulenza dei batteri in culture o biofilm è importante nelle impostazioni di ricerca e assistenza sanitaria. Qui, descriviamo un metodo versatile, veloce e relativamente semplice per quantificare la virulenza batterica. L’organismo eucariote Dictyostelium discoideum (ameba) viene utilizzato come organismo modello ospite. D. discoideum è stato utilizzato come un host di identificare i fattori di virulenza di Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 e altri batteri6,7 ,8 ed è suscettibile in gran parte gli stessi fattori di virulenza che uccidono le cellule di mammiferi tra cui tipo III secrezione9,10. Le analisi precedenti di virulenza usando d. discoideum hanno coinvolto l’esposizione prolungata dei batteri con d. discoideum cellule nel corso di ore3,4,5. Il protocollo, qui, presenta un metodo rapido per determinare virulenza utilizzando questa ameba. Questo protocollo (Figura 1) descrive come: (1) crescere le amebe axenically (in assenza di batteri), (2) crescere batteri per il dosaggio, (3) preparare i batteri e cellule dell’ospite per la microscopia, (4) eseguire epifluorescenza e (5) analizzare l’ameba fluorescenza.
Amebe sono inizialmente striate fuori dalle scorte congelate e cresciute su un prato di Escherichia coli (Escherichia coli), dove le amebe producono spore. Queste spore sono raccolte e inoculate in un terreno arricchito per la crescita axenica. Le amebe sono mantenute attraverso axenica crescita in condizioni di sostanza-ricco finché non sono pronti per essere mescolato con i batteri per la valutazione della virulenza batterica. La sopravvivenza o la morte delle amebe è quantificata misurando la fluorescenza della calceina-acetossimetil (calceina-AM), che è spaccati dalle esterasi intracellulari e, quindi, attivato per fluorescenza11,12. Amebe Live presentano poca o nessuna fluorescenza considerando che ha sottolineato e le cellule morte reagiscono intensamente. Questo risultato è dovuto un piccolo o nessun incorporazione di calceina-AM nel sane amebe e incorporazione e scissione del substrato in amebe stressato13. Questo comportamento è in particolare distinto dalla fluorescenza di calceina-AM in cellule di mammifero11,14,15,16.
Batteri che saranno valutati per la virulenza sono coltivati separatamente. Qui, descriviamo come misurare la virulenza dell’agente patogeno opportunista p. aeruginosa e come quantificare la virulenza di planctonico (nuoto) e collegata alla superficie sotto-popolazioni di dettaglio. Questo protocollo può essere adattato per testare la virulenza di altri batteri. Nella sezione risultati rappresentante, indichiamo che la virulenza è attivato in cellule collegata alla superficie ed è basso in cellule planctoniche, che è stato segnalato precedentemente13. Virulenza-attivato collegata alla superficie p. aeruginosa uccide amebe mentre non virulento cellule planctoniche sono consumate da amebe. Se la virulenza dei batteri planctonici è esclusivamente essere dosata, i batteri possono essere coltivati in provette di coltura ordinaria anziché utilizzare capsule di Petri, come descritto nel protocollo.
La crescita di amebe e p. aeruginosa culture deve essere coordinata, tali che p. aeruginosa culture raggiungono la fase di crescita previsto mentre le amebe crescono allo stato stazionario in condizioni di ricco di sostanze nutritive. Questa condizione richiede in genere culture amebe da diluire con almeno 1 giorno prima di quando sono mescolati con i batteri. Amebe e batteri sono immobilizzati utilizzando pastiglie agar, sono co-incubati per 1 h e imaging utilizzando una risoluzione bassa (10 X, apertura numerica 0.3) proteina fluorescenza oggettiva, verde (GFP) filtri e una termocamera. Analisi possono essere eseguite utilizzando software liberamente disponibile di ImageJ o software di analisi di immagine personalizzato. La nostra analisi è stata effettuata usando il nostro software scritto utilizzando un pacchetto di analisi scientifica13. Il software dovrebbe creare una maschera utilizzando l’immagine di contrasto di fase ed estrarre valori di fluorescenza dalle aree mascherate nell’immagine di fluorescenza. Valori di fluorescenza sono media almeno 100 cellule, con conseguente un indice di uccisione di host numerici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo veloce e quantitativo per analizzare la virulenza di p. aeruginosa. Questo protocollo può essere testato con altri batteri. Tuttavia, è importante tenere a mente che il mezzo di crescita dovrebbe essere compatibile con le condizioni di crescita di ameba. In particolare, abbiamo ottimizzato il protocollo usando PS:DB come mezzo di crescita batterica. Se vengono utilizzati altri supporti, può essere necessario eseguire un controllo di sola media di crescita in cui non sono p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP e AS ha scritto e rivisto il manoscritto. KP eseguito gli esperimenti e l’analisi. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) carriera transizione premio (K22AI112816) per As
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
Riferimenti
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O’Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
