Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.
Abstract
Ensayos de virulencia bacterianos tradicionales implican la exposición prolongada de las bacterias a lo largo de varias horas a las células del huésped. Durante este tiempo, las bacterias pueden experimentar cambios en la fisiología debido a la exposición al ambiente de crecimiento de anfitrión y la presencia de las células hospedadoras. Hemos desarrollado un ensayo para medir rápidamente el estado de virulencia de las bacterias que reducen al mínimo el grado al cual las bacterias crecen en presencia de las células del huésped. Bacterias y amebas se mezclan juntos e inmovilizadas en un solo plano de proyección de imagen con una almohadilla de agar. El procedimiento utiliza imágenes por fluorescencia unicelular con calceína-acetoxymethyl ester (calceína-AM) como un indicador de salud de la célula huésped. La fluorescencia de las células huésped se analiza después de 1 h de la exposición de las células del huésped a las bacterias mediante microscopía de epifluorescencia. Software de análisis de imagen se utiliza para calcular un índice de matanza de host. Este método se ha utilizado para medir la virulencia dentro de planctónicos y une superficie de Pseudomonas aeruginosa las subpoblaciones durante la etapa inicial de formación de biopelículas y puede ser adaptado a otras bacterias y otras etapas del crecimiento de biopelícula. Este protocolo proporciona un método rápido y robusto para medir la virulencia y evita muchas de las complejidades asociadas con el crecimiento y mantenimiento de líneas de células de mamífero. Fenotipos de virulencia mide aquí con las amebas también han sido validados con los macrófagos de ratón. En particular, este análisis fue utilizado para establecer esa virulencia de upregulates accesorio superficie en p. aeruginosa.
Introduction
La infección bacteriana es una de las principales causas de mortalidad en humanos y animales1,2. La capacidad para medir la virulencia de las bacterias en cultivos o biofilms es importante en entornos de cuidado de la salud y la investigación. Aquí, describimos un método versátil, rápido y relativamente simple para cuantificar la virulencia bacteriana. El organismo eucariota Dictyostelium discoideum (ameba) se utiliza como organismo modelo host. D. discoideum se ha utilizado como un host para identificar factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 y otras bacterias6,7 ,8 y es susceptible a en gran parte los mismos factores de virulencia que matan las células mamíferas, incluyendo el tipo III secreción9,10. Anteriores ensayos de virulencia mediante D. discoideum han implicado la exposición prolongada de las bacterias con D. discoideum las células en el transcurso de horas3,4,5. Protocolo, aquí, presenta un método rápido de determinación de virulencia usando esta ameba. Este protocolo (figura 1) se describe como: (1) crecen las amebas axenically (en ausencia de bacterias), (2) crecer bacterias para el análisis, (3) preparar las bacterias y las células del huésped para microscopía, (4) realizan microscopía de epifluorescencia y (5) analizan los ameba fluorescencia.
Amebas inicialmente con mechas hacia fuera de la acción congelada y crecidas en un jardín de Escherichia coli (e. coli), donde las amebas producen esporas. Estas esporas son seleccionadas y se inocula en un medio enriquecido para el crecimiento axénico. Las amebas se mantienen a través del crecimiento axénico en condiciones ricas en nutrientes hasta que están listos para ser mezclados con bacterias para la evaluación de la virulencia bacteriana. La supervivencia o la muerte de las amebas se cuantifica midiendo la fluorescencia de calceína-acetoxymethyl (calceína-AM), que es hendida por esterasas intracelulares y, por lo tanto, activado por fluorescencia11,12. Amebas vivo exhiben poca o ninguna fluorescencia mientras que subrayó y fluorescencia de células muertas intensamente. Este resultado es debido a poca o ninguna incorporación de calceína-AM en amebas saludables e incorporación y clivaje del sustrato en amebas estresado13. Este comportamiento es notablemente distinto de fluorescencia de calceína-AM en células de mamífero11,14,15,16.
Las bacterias que se aplicará para la virulencia se cultivan por separado. Aquí, describimos cómo medir la virulencia de los patógenos oportunistas p. aeruginosa y detalle cómo cuantificar la virulencia de planctónico (natación) y las subpoblaciones conectado a superficie. Este protocolo puede ser adaptado para probar la virulencia de otras bacterias. En la sección de resultados de representante, demostramos que la virulencia se activa en las células de superficie conectado y es baja en las células planctónicas, que fue divulgado previamente13. Virulencia-activado superficie unida p. aeruginosa mata amebas mientras no virulenta células planctónicas son consumidas por las amebas. Si únicamente se es analizar la virulencia de las bacterias planctónicas, las bacterias pueden ser cultivadas en tubos de cultivo ordinario en lugar de utilizar placas de Petri como se describe en el protocolo.
El crecimiento de las amebas y las culturas de p. aeruginosa debe coordinarse que cultivos de p. aeruginosa alcanzan la fase de crecimiento previsto, mientras que las amebas están creciendo en estado estacionario en condiciones ricas en nutrientes. Esta condición requiere típicamente culturas amebas a diluirse al menos 1 día antes cuando se mezclan con las bacterias. Amebas y bacterias se inmovilizan usando teclas de agar son co se incubó por 1 h y fotografiado con una resolución baja (10 X, abertura numérica 0.3) filtros de la proteína de fluorescencia verde, objetiva (GFP) y una cámara. Análisis se pueden realizar usando el software ImageJ libremente disponible o modificado para requisitos particulares software de análisis de imagen. Nuestro análisis fue realizado usando nuestro propio software escrito usando un paquete de análisis científico13. El software debe crear una máscara con la imagen de contraste de fase y extraer valores de fluorescencia de las áreas enmascaradas en la imagen de fluorescencia. Valores de fluorescencia son un promedio sobre por lo menos 100 células, resultando en un índice de matanza de host numéricos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método rápido y cuantitativo para analizar la virulencia en p. aeruginosa. Este protocolo puede ser probado con otras bacterias. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el medio de crecimiento debe ser compatible con las condiciones de crecimiento de la ameba. En particular, hemos optimizado el protocolo usando PS:DB como el medio de crecimiento bacteriano. Si se utilizan otros medios, puede ser necesario realizar un control del crecimiento sólo de los medios de comunicación…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP y como escribieran y revisaron el manuscrito. KP realiza los experimentos y el análisis. Este trabajo fue apoyado por el Premio de transición de carrera de institutos nacionales de salud (NIH) (K22AI112816) a AS.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
Riferimenti
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