Génération d’un modèle de Cancer du sein métastatique orthotopique murin et effectuant une mastectomie radicale Murine

Summary

Nous introduisons un modèle de cancer du sein orthotopique murin et modèle de mastectomie radicale avec la technologie de la bioluminescence pour quantifier le fardeau tumoral pour imiter la progression du cancer du sein humain.

Abstract

Modèles de souris in vivo pour évaluer la progression du cancer du sein sont essentiels pour la recherche sur le cancer, y compris les développements précliniques de médicaments. Cependant, la majorité des détails techniques et pratiques est généralement omise dans les manuscrits publiés qui, par conséquent, fait qu’il est difficile de reproduire les modèles, en particulier lorsqu’il s’agit de techniques chirurgicales. Bioluminescence technologie permet l’évaluation de petites quantités de cellules cancéreuses même lorsqu’une tumeur n’est pas palpable. Utilisant les cellules cancéreuses exprimant luciférase, nous établissons une technique d’inoculation d’orthotopique du sein cancer avec un taux élevé de tumorigenèse. Métastases pulmonaires est évaluée en utilisant une technique ex vivo . Nous, ensuite, établir un modèle de mastectomie avec un taux faible de récidive locale pour évaluer la charge de tumeur métastatique. Dans les présentes, nous décrire en détail, les techniques chirurgicales d’implantation orthotopique et mastectomie pour cancer du sein avec un taux élevé de tumorigenèse et les taux de récidive locale faible, respectivement, pour améliorer l’efficacité de modèle pour le cancer du sein.

Introduction

Modèles animaux jouent un rôle clé dans la recherche sur le cancer. Quand une hypothèse est démontrée in vitro, il devrait être testé in vivo pour évaluer sa pertinence clinique. La progression du Cancer et des métastases sont souvent mieux captés par des modèles animaux par rapport à des modèles in vitro, et il est essentiel de tester un nouveau médicament chez un modèle animal d’une étude préclinique pour drug development^1,2. Toutefois, les détails techniques de l’expérimentation animale ne sont souvent pas bien décrites dans les articles publiés, rendant difficile à reproduire le modèle avec succès. En effet, les auteurs qui ont établi ces modèles orthotopiques de l’inoculation et la mastectomie a traversé un processus long et rigoureux de tâtonnements. Le taux de réussite de tumorigénèse après que inoculation de cellules de cancer est un des facteurs clés pour déterminer le succès et l’efficacité d’un animal étude³. La lignée cellulaire et le nombre de cellules à ensemencer, le site de l’inoculation et la souche des souris sont tous des facteurs importants. Il est bien connu qu’il y a des énormes variations dans les résultats de l’expérimentation animale en raison des différences individuelles, par rapport aux techniques in vitro. À l’aide d’un modèle bien établi avec une technique standard est donc important d’obtenir des résultats constants, pour améliorer l’efficacité de l’expérimentation animale et d’éviter des résultats trompeurs.

Cet article fournit des techniques bien établies⁴ pour générer des modèles du cancer du sein orthotopique et la mastectomie de souris. Les objectifs de ces méthodes sont 1) pour imiter la progression du cancer du sein humain et cours de traitement et 2) pour mener des expériences in vivo avec une plus grande efficacité et les taux de réussite plus élevés par rapport aux autre inoculation de cancer du sein ou des techniques de mastectomie. Dans inoculation de cellules du cancer orthotopique pour imiter la progression du cancer du sein humain, nous choisissons les coussinets adipeux mammaire #2 comme un site d’inoculation, qui se trouve dans la poitrine. Dans la plupart des études, les cellules cancéreuses du sein sont inoculées par voie sous-cutanée⁵. Cette technique ne nécessite pas de chirurgie et, par conséquent, il est simple et directe. Toutefois, le microenvironnement sous-cutanée est très différent du microenvironnement de la glande mammaire, qui se traduit par la progression du cancer différentes et des profils moléculaires même^6,7. Certaines études utilisent la glande mammaire #4, qui se trouve dans l’abdomen, comme un lieu d’inoculation⁶. Toutefois, puisque les glandes mammaires #4 sont localisés dans l’abdomen, le patron le plus souvent métastatique est carcinose péritonéale⁷, qui se produit avec moins de 10 % de cancer du sein métastatique du cancer⁸. Générée par la technique présentée ici, dans la glande mammaire #2, le cancer du sein métastase dans le poumon, qui est l’un des plus courants sites métastatiques du sein cancer⁹.

Avec cette technique, le but est aussi de parvenir à un taux plus élevé de la tumorigenèse avec variabilité de taille de tumeur minime par rapport à d’autres techniques d’inoculation du cancer du sein. Pour ce faire, les cellules cancéreuses en suspension dans un mélange de protéines gélatineux sont inoculés sous vision directe par une incision de paroi thoracique antérieur médian. Cette technique produit un taux élevé de tumorigenèse avec moins de variabilité dans la taille de la tumeur et de la forme par rapport à l’injection sous-cutanée ou non chirurgicales, comme indiqué précédemment^3,7.

Nous introduisons également une technique de mastectomie radicale de souris dans lequel la tumeur du sein orthotopique est réséquée avec les tissus environnants et les ganglions lymphatiques axillaires. Dans le contexte clinique, la norme de soins pour les patients atteints de cancer du sein sans maladie de métastases à distance est une mastectomie^10,11. Avant la mammectomie, métastases ganglionnaires axillaires est recensée par imagerie et sentinelle biopsie ganglionnaire. S’il n’y a aucun signe de métastases aux ganglions axillaires, le patient est ensuite traité avec une mastectomie totale ou partielle, dans laquelle la résection des ganglions axillaires est omise. Mastectomie totale est une technique de résection du cancer avec le tissu mammaire tout en bloc, tandis que Mastectomie partielle est à la résection du cancer avec une marge d’entourant le tissu mammaire normal seulement, conservant ainsi le tissu mammaire normal restant dans le patient. Cependant, les patients qui préservent le tissu mammaire normal qui reste après une mastectomie partielle doivent radiothérapie postopératoire pour éviter une récidive locale¹⁰. Les patients ayant des métastases ganglionnaires axillaires procéder à une mastectomie radicale qui supprime le cancer du sein avec la normale tous les ganglions axillaires et de tissus des seins et envahirent les tissus en bloc^10,11. Chez la souris, la surveillance des radiations de métastases et/ou post-opératoire des ganglions axillaires n’est pas raisonnable ni réalisable. Ainsi, nous utilisons la technique de la mastectomie radicale pour éviter les métastases ganglionnaires axillaires ou local.

Inoculation de cellules de cancer par l’intermédiaire de la veine caudale est le plus commun poumon métastase souris modèle¹², la soi-disant « métastases expérimentale ». Ce modèle est facile à produire et ne nécessite pas de chirurgie ; Cependant, il n’imite pas la progression du cancer du sein humain qui peut entraîner un comportement différent de la maladie métastatique. Pour imiter la cure de cancer du sein humain où les métastases se produit souvent après une mastectomie, la tumeur primitive est retirée après l’inoculation de cellules orthotopique du cancer. Cette technique produit moins récidive locale par rapport à la résection de tumeur simple, comme indiqué précédemment¹³et est utile pour les nouvelles thérapeutiques, des études précliniques et pour les études de recherche pour le cancer du sein métastatique. Les techniques décrites ici sont appliquent pour la plupart breast cancer orthotopique modèle expériences. Toutefois, il est important de considérer que le mélange gélatineux de protéine peut affecter le microenvironnement et chirurgie peut influer sur la réponse de stress/immunitaire¹⁴. Donc, les enquêteurs étudient le microenvironnement et/ou le stress/système immunitaire devraient être conscients du risque, facteurs de confusion.

Protocol

L’approbation de la Roswell Park Cancer Center Institutional Animal prise en charge globale et utilisation a été obtenue pour toutes les expériences. Remarque : Neuf à douze semaines femelles BALB/c souris sont obtenus. Les cellules 4 t 1-luc2, une souris Adénocarcinome mammaire lignée cellulaire provenant de souris BALB/c qui a été conçu à la luciférase express, sont utilisés. Ces cellules sont cultivées dans un milieu 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPM…

Representative Results

Le but du modèle orthotopique consiste à mimer la progression du cancer chez l’humain (c’est-à-dire, la croissance de la tumeur primitive, suivie de métastases ganglionnaires et métastases pulmonaires puis lointain)15. Après l’inoculation de cellules de cancer, la bioluminescence est quantifiée régulièrement (deux à trois fois / semaine) (Figure 1 a). La bioluminescence dans les poumons est plus profond et plus p…

Discussion

Pour la dernière décennie, nous avons mis en place plusieurs modèles de cancer murine, y compris du sein cancer modèles^{3,7,13,16,20,21}. Auparavant, nous avons démontré que breast cancer cell orthotopique l’inoculation dans le tissu de la glande mammaire sous vision directe produit une tumeur plus grande avec moins de …

Materials

Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture