Genererer en Murine Orthotopic metastatisk brystkræft kræft Model og udfører Murine radikale mastektomi

Summary

Vi indføre en murine orthotopic bryst kræft model og radikal mastektomi model med bioluminescens teknologi at kvantificere tumor byrden for at efterligne menneskelige bryst kræft progression.

Abstract

In vivo musemodeller at vurdere bryst kræft progression er afgørende for kræftforskning, herunder prækliniske stof udvikling. Men fleste af de praktiske og tekniske detaljer er almindeligt udeladt i udgivne manuskripter, som derfor gør det udfordrende for at reproducere modeller, især når det drejer sig om kirurgiske teknikker. Bioluminescens teknologi giver mulighed for evaluering af små mængder af kræftceller, selv når en tumor ikke er håndgribelig. Udnytte luciferase-udtrykker kræftceller, etablere vi et bryst kræft orthotopic podning teknik med en høj tumordannelse sats. Lunge metastaser vurderes udnytter en ex vivo -teknik. Vi så, opstille en mastektomi model med en lav lokale tilbagefald sats at vurdere metastatisk tumor byrde. Heri, beskriver vi, i detaljer, de kirurgiske teknikker til orthotopic implantation og mastektomi for brystkræft med en høj tumordannelse sats og lave lokale gentagelse satser, henholdsvis, for at forbedre bryst kræft model effektivitet.

Introduction

Dyremodeller spille en nøglerolle i kræftforskning. Når en hypotese er vist in vitro, bør det blive testet in vivo til at vurdere klinisk relevans. Kræft progression og metastaser er ofte bedre fanget af dyremodeller i forhold til in vitro-modeller, og det er vigtigt at teste et nyt lægemiddel i en dyremodel som en prækliniske undersøgelse for drug udvikling^1,2. Men de tekniske detaljer vedrørende dyreforsøg er ofte ikke godt beskrevet i offentliggjorte artikler, at gøre det udfordrende at gengive modellen med succes. Faktisk gik forfatterne som etableret disse orthotopic podning og mastektomi modeller igennem lange og stringente processer af trial and error. Succesraten for tumordannelse efter kræft celle podning er en af de vigtigste faktorer til at bestemme succesen og effektiviteten af et dyr undersøgelse³. Cellelinie og antallet af celler, der skal podes, webstedet podning og stamme af mus er alle vigtige faktorer. Det er velkendt, at der er store variationer i resultaterne af dyreforsøg på grund af individuelle forskelle, i forhold til in vitro-teknikker. Derfor, ved hjælp af en veletableret model med en standard teknik er vigtigt at opnå stabile resultater, at forbedre effektiviteten af dyreforsøg, og at undgå vildledende resultater.

Denne hvidbog indeholder veletablerede teknikker⁴ for at generere breast cancer orthotopic og mastektomi musemodeller. Formålet med disse metoder er 1) til at efterligne menneskelige bryst kræft progression og behandlingsforløb og 2) til at gennemføre in vivo forsøg med større effektivitet og højere succesrate i forhold til andre bryst kræft podning eller mastektomi teknikker. I orthotopic kræft celle podning, for at efterligne menneskelige bryst kræft progression, vælger vi #2 brystkirtler fedt pad som en podning site, som er placeret i brystet. I de fleste af undersøgelserne, podes brystkræftceller subkutant⁵. Denne teknik kræver ikke operation, og dermed, det er simpelt og ligetil. Men, den subkutane mikromiljø er helt forskellig fra mælkekirtlen mikromiljø, hvilket resulterer i forskellige kræft progression og endda molekylære profiler^6,7. Nogle undersøgelser bruges mælkekirtlen #4, som er placeret i maven, som en podning site⁶. Men da #4 mælkekirtlerne er placeret i maven, den mest almindelige metastatisk mønster er peritoneal carcinomatosis⁷, som opstår i forekommer med mindre end 10% af metastatisk brystkræft kræft⁸. Brystkræft genereret af teknikken præsenteret her, i mælkekirtlen #2 metastaserer til lunge, som er en af de mest almindelige brystkræft kræft metastatisk websteder⁹.

Med denne teknik er målet også at opnå en højere tumordannelse med minimal tumor størrelse variation i forhold til andre bryst kræft podning teknikker. For at gøre det, podes kræftceller suspenderet i en gelatinøse protein blanding under direkte udsyn gennem en median forreste brystet væg snit. Denne teknik giver en høj tumordannelse sats med mindre variation i tumorstørrelse og form i forhold til subkutan eller ikke-kirurgiske injektion, som tidligere rapporteret^3,7.

Vi introducerer også en mus radikale mastektomi teknik hvor orthotopic bryst tumor resektion med det omgivende væv og aksil lymfeknuder. I de kliniske omgivelser er standarden for pleje af brystkræftpatienter uden at fjerne metastase sygdom mastektomi^10,11. Før en mastektomi, er axillær lymfeknude metastaser overvåget af imaging og sentinel lymfeknude biopsi. Hvis der er ingen tegn på axillær lymfeknude metastase, behandles patienten derefter med en hel eller delvis mastektomi, hvori axillær lymfeknude resektion er udeladt. Samlede mastektomi er en teknik til at resect brystkræft med hele brystvævet blokoverførslen, delvis mastektomi er at resect brystkræft med en margin af omkringliggende normalt brystvæv kun, dermed bevare den resterende normale brystvæv i den patienten. Patienter, der bevarer resterende normale brystvæv efter en delvis mastektomi kræver imidlertid postoperativ strålebehandling at undgå lokal recidiv¹⁰. Patienter, der har axillær lymfeknude metastase foretage radikale mastektomi, som fjerner brystkræft med alle normale bryst væv og aksil lymfeknuder og invaderede væv en blok^10,11. I musemodel er overvågning af axillær lymfeknude metastase og/eller postoperativ stråling ikke rimeligt eller gennemførlig. Dermed, vi udnytte den radikale mastektomi teknik for at undgå lokal eller axillær lymfeknude metastase.

Kræft celle inokulation via hale vene er den mest almindelige lunge metastase musen model¹², den såkaldte “eksperimentelle metastase”. Denne model er let at oprette og kræver ikke kirurgi; det dog ikke efterligne menneskelige bryst kræft progression, hvilket kan resultere i forskellige metastatisk sygdom adfærd. For at efterligne den menneskelige bryst kræft behandlingsforløb hvor metastase ofte opstår efter mastektomi, er den primære tumor fjernet efter orthotopic kræft celle podning. Denne teknik producerer mindre lokalt recidiv i forhold til simple tumor resektion, som tidligere rapporteret¹³, og er nyttig for romanen therapeutics, prækliniske undersøgelser, og metastatisk brystkræft kræft forskningsundersøgelser. De teknikker, der er beskrevet her er gældende for de fleste breast cancer orthotopic model eksperimenter. Det er dog vigtigt at overveje at gelatinøse protein blandingen kan påvirke mikromiljø og kirurgi kan påvirke stress/immun svar¹⁴. Efterforskere studerer mikromiljø og/eller stress/immunrespons bør derfor klar over potentialet confounding faktorer.

Protocol

Godkendelse fra Roswell Park omfattende Cancer Center institutionelle Animal Care og brug udvalget blev opnået for alle eksperimenter. Bemærk: Ni til tolv uger gamle kvindelige BALB/c mus er opnået. 4T1-luc2 celler, en mus brystkirtler adenocarcinom cellelinie stammer fra BALB/c-mus der er blevet manipuleret til at udtrykke luciferase, der bruges. Disse celler er kulturperler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% føtal bovint serum (FBS). <p clas…

Representative Results

Formålet med orthotopic modellen er at efterligne menneskelige kræft progression (dvs., væksten af den primære tumor efterfulgt af lymfeknude metastase og derefter fjerne lunge metastase)15. Efter kræft celle podning, bioluminescens er kvantificeret regelmæssigt (to til tre gange / uge) (figur 1A). Bioluminescens i lungerne er dybere og mindre end den primære læsion. Bioluminescens afspejler hovedsagelig den primære t…

Discussion

For det sidste årti, har vi oprettelse af flere murine kræftmodeller, herunder breast cancer modeller^{3,7,13,16,20,21}. Tidligere var vist vi at bryst kræft celle orthotopic podning i mælkekirtlen vævet under direkte udsyn produceret en større tumor med mindre størrelse variation i forhold til at indsprøjte celler omkri…

Materials

Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture