Genererer en Murine Orthotopic metastatisk brystkreft Cancer modell og utføre Murine radikale mastektomi

Summary

Introduserer vi en murine orthotopic bryst kreft modell og radikale mastektomi modell med bioluminescens teknologi å kvantifisere svulst byrden å etterligne menneskelig bryst kreft progresjon.

Abstract

In vivo musen modeller for å vurdere bryst kreft progresjon er avgjørende for kreftforskning, inkludert prekliniske stoff utviklingen. Men utelates flertallet av praktisk-teknisk detaljene vanligvis i publiserte manuskripter som, derfor gjør det utfordrende for å reprodusere modellene, spesielt når det innebærer kirurgiske teknikker. Bioluminescens teknologi tillater for vurdering av små mengder kreftceller selv når en svulst ikke er håndgripelig. Bruker luciferase-uttrykke kreftceller, etablere vi en bryst kreft orthotopic inoculation teknikk med en høy tumorigenesis rate. Lunge metastasering vurderes utnytte en ex vivo teknikk. Vi deretter opprette en mastektomi modell med en lav lokale tilbakefall å vurdere metastatisk svulst byrden. Her beskriver vi, i detalj, kirurgiske teknikker for orthotopic implantasjon og mastektomi for brystkreft med en høy tumorigenesis hastighet og lav lokale gjentakelse priser, henholdsvis for å forbedre bryst kreft modell effektivitet.

Introduction

Dyremodeller spille en nøkkelrolle i kreftforskning. Når en hypotese er bevist i vitro, bør det bli testet i vivo å vurdere sin kliniske relevans. Kreft progresjon og metastasering er ofte bedre fanget av dyremodeller sammenlignet med i vitro modeller, og det er viktig å teste et nytt legemiddel i en dyremodell som en prekliniske studie for narkotika utvikling^1,2. Men er de tekniske detaljene for dyreforsøk ofte ikke godt beskrevet i publiserte artikler, noe som gjør det utfordrende å reprodusere modellen vellykket. Faktisk gikk forfatterne som etablerte modellene orthotopic inokuleringen og mastektomi gjennom lang og grundig prosesser prøving og feiling. Suksessrate på tumorigenesis etter kreft cellen vaksinering er en av de viktigste faktorene å avgjøre suksess og effektiviteten av et dyr studere³. Cellen linjen og antall celler å vaksinere, vaksinering området og belastningen av mus er alle viktige faktorer. Det er velkjent at det er store variasjoner i resultatene av dyreforsøk på grunn av individuelle forskjeller, sammenlignet med i vitro teknikker. Derfor er bruker en veletablert modell med en standard teknikk viktig å få stabile resultater, forbedre effektiviteten i dyreforsøk og unngå villedende resultater.

Dette dokumentet gir veletablerte teknikker⁴ for å generere bryst kreft orthotopic og mastektomi musen modeller. Målet for disse metodene er 1) for å etterligne menneskelige bryst kreft progresjon og behandling kurs og 2) for å utføre i vivo eksperimenter med større effektivitet og høyere suksessrate sammenlignet med andre bryst kreft inoculation eller mastektomi teknikker. I orthotopic kreft cellen inoculation, for å etterligne menneskelige bryst kreft progresjon, velger vi #2 mammary fett puten som en inoculation site, som ligger i brystet. I de fleste studiene, brystkreft celler er inokulert subcutaneously⁵. Denne teknikken krever ikke kirurgi, og dermed er det enkel og grei. Subkutan microenvironment er imidlertid ganske ulik melkekjertlene microenvironment, som resulterer i forskjellige kreft progresjon og selv molekylær profiler^6,7. Noen studier bruker melkekjertlene #4, som ligger i magen, som en inoculation området⁶. Siden #4 brystkjertlene ligger i magen, er imidlertid de vanligste metastatisk mønster peritoneal carcinomatosis⁷, som oppstår med mindre enn 10% av metastatisk brystkreft kreft⁸. Brystkreft generert av teknikken presentert her i melkekjertlene #2 metastasizes til lungene, som er en av de vanligste bryst kreft metastatisk nettsteder⁹.

Med denne teknikken er målet også å oppnå en høyere tumorigenesis rate med minimal tumor størrelse variasjon i forhold til andre bryst kreft inoculation teknikker. Gjør er kreftceller suspendert i en geléaktige proteinet blanding inokulert under direkte visjon gjennom en median fremre brystet veggen snitt. Denne teknikken gir en høy tumorigenesis rate med mindre variasjon i tumor størrelse og form i forhold til subkutan eller ikke-kirurgisk injeksjon, tidligere rapportert^3,7.

Vi introduserer også en mus radikale mastektomi teknikk der orthotopic brystet svulsten resected med omkringliggende vev og axillaris lymfeknuter. I klinisk setting er standarden på omsorg for brystkreftpasienter uten fjernt metastasering sykdom mastektomi^10,11. Før en mastektomi, er axillaris lymph node metastasering undersøkt av bildebehandling og sentinel lymfeknute biopsi. Hvis det er ingen bevis for axillary lymph node metastasering, behandles deretter pasienten med en total eller delvis mastektomi, der axillaris lymfeknute reseksjon er utelatt. Totalt mastektomi er en teknikk for å resect brystkreft med hele brystvev en bloc mens delvis mastektomi til resect brystkreft med en margin på rundt normal brystvevet, dermed spare gjenværende normal brystvevet i den pasient. Pasienter som bevare igjen vanlige brystvevet etter en delvis mastektomi krever imidlertid postoperativ strålebehandling å unngå lokale gjentakelse¹⁰. Pasienter som har axillaris lymph node metastasering gjennomføre radikale mastektomi som fjerner brystkreft med alle normal bryst vev og aksillær lymfeknuter og invaderte vev en blokk^10,11. I musemodell er overvåking for axillary lymph node metastasering og/eller post-operativ stråling ikke fornuftig eller gjennomførbart. Dermed kan bruke vi radikale mastektomi teknikken for å unngå lokale eller axillaris lymph node metastasering.

Kreft cellen inoculation via hale venen er den vanligste lunge metastasering mus modell¹², såkalte “eksperimentelle metastasering”. Denne modellen er lett å generere og krever ikke operasjonen. men det ikke etterligne menneskelig bryst kreft progresjon som kan resultere i forskjellige metastaser atferd. For å etterligne menneskelige bryst kreft behandling kurset der metastasering skjer ofte etter mastektomi, fjernes den primære svulsten etter orthotopic kreft cellen vaksinering. Denne teknikken gir mindre lokale gjentakelse sammenlignet med vanlig svulst resection, som tidligere rapportert¹³, og er nyttig for romanen therapeutics, preklinisk studier, og for metastatisk brystkreft kreft forskningsstudier. Teknikkene som beskrives her gjelder for de fleste bryst kreft orthotopic modell eksperimenter. Det er imidlertid viktig å tenke at geléaktige protein blandingen kan påvirke microenvironment og kirurgi kan påvirke stress/immun respons¹⁴. Derfor bør etterforskere studere i microenvironment og/eller stress/immunrespons være klar over potensielle confounding faktorer.

Protocol

Godkjenning fra Roswell Park omfattende Cancer Center institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ble oppnådd for alle eksperimenter. Merk: Ni til tolv uker gamle kvinnelige BALB/c mus er oppnådd. 4T1-luc2 celler, en mus mammary adenocarcinoma cellen linje fra BALB/c mus som er konstruert for å uttrykke luciferase, brukes. Disse cellene er kultivert i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% fosterets bovin serum (FBS). 1. forber…

Representative Results

Formålet med den orthotopic modellen er å etterligne menneskelige kreft progresjon (dvs., veksten av den primære svulsten etterfulgt av lymph node metastasering og deretter fjerne lunge metastasering)15. Etter kreft cellen inoculation, bioluminesens er kvantifisert regelmessig (to til tre ganger / uke) (figur 1A). Bioluminesens i lungene er dypere og mindre enn primære lesjonen. Bioluminesens gjenspeiler hovedsakelig prim?…

Discussion

For det siste tiåret, har vi vært å etablere flere murine kreft modeller, inkludert bryst kreft modeller^{3,7,13,16,20,21}. Tidligere har vist vi at bryst kreft celle orthotopic inoculation inn i melkekjertlene vevet under direkte visjon produsert en større svulst med mindre størrelse variasjon i forhold til injisere cellen…

Materials

Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture