Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino

Summary

Apresentamos um modelo de câncer de mama murino ortotópico e modelo de mastectomia radical com tecnologia de bioluminescência para quantificar a carga do tumor para imitar a progressão do câncer de mama humano.

Abstract

Modelos de rato in vivo para avaliar a progressão do câncer de mama são essenciais para pesquisa do câncer, incluindo o desenvolvimentos de drogas pré-clínicos. No entanto, a maioria dos detalhes práticos e técnicos é comumente omitida em artigos publicados e que, portanto, torna difícil reproduzir os modelos, particularmente quando envolve técnicas cirúrgicas. Tecnologia de bioluminescência permite para a avaliação de pequenas quantidades de células de câncer, mesmo quando um tumor não é palpável. Utilizando as células cancerosas do luciferase-expressando, estabelecemos uma técnica de inoculação ortotópico de cancro da mama com uma taxa elevada de tumorigênese. Metástase pulmonar é avaliada utilizando uma técnica ex vivo . Nós, então, estabelecer um modelo de mastectomia com uma taxa baixa de recorrência local para avaliar a carga de tumor metastático. Aqui, descrevemos, em pormenor, as técnicas cirúrgicas de implantação ortotópico e mastectomia por câncer de mama, com uma taxa elevada de tumorigênese e taxas de recidiva local baixo, respectivamente, para melhorar a eficiência de modelo de câncer de mama.

Introduction

Modelos animais desempenham um papel chave na investigação do cancro. Quando uma hipótese é comprovada in vitro, devem ser testado in vivo para avaliar a sua relevância clínica. Metástase e progressão de câncer muitas vezes melhor capturados por modelos animais em comparação com modelos in vitro, e é essencial para testar uma nova droga em um modelo animal, como um estudo pré-clínicos para desenvolvimento de drogas^1,2. No entanto, os detalhes técnicos das experiências com animais muitas vezes não são bem descritos em artigos publicados, tornando-se desafiador para reproduzir o modelo com sucesso. Com efeito, os autores que criaram estes modelos de inoculação e mastectomia ortotópico passaram longos e rigorosos processos de tentativa e erro. A taxa de sucesso de tumorigênese após inoculação de células de câncer é um dos fatores-chave para determinar o sucesso e a eficiência de um animal estudo³. A linha de celular e o número de células para inocular, local de inoculação e a tensão dos ratos são fatores importantes. É sabido que existem enormes variações nos resultados das experiências com animais devido às diferenças individuais, em comparação com técnicas in vitro. Portanto, usar um modelo bem estabelecido com uma norma técnica é importante para obter resultados estáveis, para melhorar a eficiência das experiências com animais e para evitar resultados enganosos.

Este documento fornece técnicas bem estabelecidas⁴ para gerar modelos de rato mama câncer ortotópico e mastectomia. Os objectivos destes métodos são 1) para imitar a progressão do câncer de mama humano e cursos de tratamento e 2) para conduzir experimentos in vivo com maior eficiência e maiores taxas de sucesso em comparação com outra inoculação de câncer de mama ou técnicas de mastectomia. Em ortotópico inoculação de células de câncer, para imitar a progressão do câncer de mama humano, nós escolhemos a almofada de gordura mamária #2 como um site de inoculação, que está localizado no peito. Na maioria dos estudos, células de câncer de mama são inoculadas subcutaneamente⁵. Esta técnica não requer cirurgia e, assim, é simples e direta. No entanto, o microambiente subcutâneo é bastante diferente do microambiente da glândula mamária, o que resulta na progressão do câncer diferentes e perfis molecular até^6,7. Alguns estudos utilizam a glândula mamária #4, que está localizada no abdômen, como um local de inoculação⁶. No entanto, uma vez que as glândulas mamárias #4 estão localizadas no abdômen, o padrão mais comum de metástase é Carcinomatose peritoneal⁷, que ocorre com menos de 10% do câncer de mama metastático⁸. Câncer de mama, gerado pela técnica apresentada aqui, na glândula mamária #2, metastatiza para o pulmão, que é um do mais comum da mama câncer metastático sites⁹.

Com esta técnica, o objetivo é também alcançar uma maior taxa de tumorigênese com variabilidade de tamanho de tumor mínima em comparação com outras técnicas de inoculação de câncer de mama. Para isso, células cancerosas, suspendidas em uma mistura gelatinosa da proteína são inoculadas sob visão direta através de uma incisão da parede torácica anterior mediana. Esta técnica produz uma taxa alta de tumorigênese com menor variabilidade no tamanho do tumor e a forma em comparação com injeção subcutânea ou não-cirúrgicos, como relatado anteriormente^3,7.

Também apresentamos uma técnica de mastectomia radical de rato em que o tumor de mama ortotópico é ressecado com os tecidos circundantes e linfonodos axilares. Na prática clínica, o padrão de atendimento para pacientes de câncer de mama sem doença metástase é mastectomia^10,11. Antes de uma mastectomia, metástase linfonodal axilar é pesquisado por biópsia de linfonodo sentinela e imagens. Se não há nenhuma evidência de metástase linfonodal axilar, o paciente é tratado então com uma mastectomia total ou parcial, em que a ressecção linfonodal axilar é omitida. Mastectomia total é uma técnica de ressecção em bloco, o câncer de mama com o tecido do peito inteiro enquanto mastectomia parcial é a ressecção de câncer de mama, com uma margem de tecido mamário normal apenas, assim conservando o restante tecido mamário normal na paciente. No entanto, pacientes que preservar o restante tecido mamário normal após uma mastectomia parcial requerem radioterapia pós-operatória, para evitar a recorrência local¹⁰. Os pacientes que têm metástase linfonodal axilar realizar mastectomia radical, que remove o câncer de mama com normal todos os seios linfáticos tecido e axilar e invadiram os tecidos pt bloco^10,11. No modelo de rato, vigilância por radiação de metástase e/ou pós operatório linfonodal axilar não é praticável ou razoável. Assim, utilizamos a técnica de mastectomia radical para evitar metástase linfonodal axilar ou local.

Inoculação de células de câncer através da veia da cauda é o mais comum pulmão metástase do mouse modelo¹², o so-called “metástase experimental”. Este modelo é fácil de gerar e não requer cirurgia; no entanto, não imitar a progressão de câncer de mama humano que pode resultar em um comportamento diferente de doença metastática. Para imitar o curso de tratamento de câncer de mama humano onde metástase ocorre frequentemente após a mastectomia, o tumor primário é removido após a inoculação de células de câncer ortotópico. Esta técnica produz menos recorrência local em comparação com ressecção simples de tumor, como relatado anteriormente,¹³e é útil para novela terapêutica, estudos pré-clínicos e para estudos de pesquisa do câncer de mama metastático. As técnicas descritas aqui são aplicáveis para a maioria dos experimentos de modelo mama câncer ortotópico. No entanto, é importante considerar que a mistura de proteína gelatinoso pode afetar o microambiente e cirurgia pode afetar a resposta de stress/imunológico¹⁴. Portanto, pesquisadores estudando o microambiente e/ou a resposta imune/stress devem estar cientes do potencial de fatores de confusão.

Protocol

Aprovação do Comité de uso e Roswell Park abrangente Cancer Center institucional Animal Care obteve-se para todos os experimentos. Nota: Nove a doze semanas de idade fêmea BALB/c os ratos são obtidos. 4T1-luc2 células, uma rato adenocarcinoma mamário linhagem celular derivada de camundongos BALB/c que foi projetada para expresso do luciferase, são usadas. Estas células são cultivadas em meio de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 10% de soro fetal bovino …

Representative Results

A finalidade do modelo de ortotópico é imitar a progressão do câncer humano (ou seja, o crescimento do tumor primário seguido por metástase linfonodal e metástases de pulmão então distante)15. Após a inoculação de células de câncer, a bioluminescência é quantificada regularmente (duas a três vezes / semana) (figura 1A). A bioluminescência nos pulmões é menor do que a lesão primária e mais profundo. A biol…

Discussion

Na última década, temos vindo a estabelecer vários modelos de murino de câncer, incluindo mama câncer modelos^{3,7,13,16,20,21}. Anteriormente, temos demonstrado que a inoculação de ortotópico de células de câncer de mama no tecido da glândula mamária, sob visão direta produziu um tumor maior com menor variabilidade…

Materials

Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture