Generación de un modelo Murino ortotópico de cáncer de mama metastásico y la realización de mastectomía Radical murino

Summary

Presentamos un modelo de cáncer de mama Murino ortotópico y mastectomía radical modelo con tecnología de bioluminiscencia para cuantificar la carga del tumor para imitar la progresión del cáncer de mama humano.

Abstract

Modelos de ratón in vivo para evaluar la progresión del cáncer de mama son esenciales para la investigación del cáncer, incluyendo el desarrollo preclínico de fármacos. Sin embargo, la mayoría de los detalles técnicos y prácticos comúnmente se omite en los manuscritos publicados que, por lo tanto, hace que sea difícil de reproducir los modelos, particularmente cuando se trata de técnicas quirúrgicas. Tecnología de bioluminiscencia permite la evaluación de pequeñas cantidades de células cancerosas incluso cuando un tumor no palpable. Utilizando las células de cáncer expresan luciferasa, establecemos una técnica de inoculación de mama cáncer ortotópico con una tasa alta de tumorigénesis. Metástasis del pulmón se evalúa utilizando una técnica ex vivo . Nosotros, entonces, establecer un modelo de mastectomía con una tasa baja de recurrencia local para evaluar la carga de tumor metastático. Adjunto, describimos, detalladamente, las técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica y mastectomía para cáncer de mama con una tasa alta de tumorigenesis y tasas de baja recurrencia local, respectivamente, para mejorar la eficiencia de modelo de cáncer de mama.

Introduction

Modelos animales juegan un papel clave en la investigación del cáncer. Cuando una hipótesis se prueba in vitro, debe ser probado in vivo para evaluar su relevancia clínica. Metástasis y progresión del cáncer son a menudo mejor capturados por los modelos animales en comparación con modelos in vitro, y es esencial para probar un nuevo fármaco en un modelo animal como un estudio preclínico de drogas desarrollo^1,2. Sin embargo, los detalles técnicos de los experimentos con animales a menudo no son bien descritos en los artículos publicados, lo que es difícil reproducir el modelo con éxito. De hecho, los autores que establecieron estos modelos de la inoculación y la mastectomía de orthotopic pasaron a través de largos y rigurosos procesos de prueba y error. La tasa de éxito de tumorigenesis después de la inoculación de células de cáncer es uno de los factores clave para determinar el éxito y la eficiencia de un animal de estudio³. La línea celular y el número de células a inocular, el sitio de inoculación y la cepa de los ratones, son factores importantes. Es bien sabido que hay enormes variaciones en los resultados de los experimentos en animales debido a las diferencias individuales, en comparación con técnicas in vitro. Por lo tanto, usando un modelo bien establecido con una técnica estándar es importante para obtener resultados estables, para mejorar la eficiencia de los experimentos con animales y para evitar resultados engañosos.

Este artículo ofrece técnicas bien establecidas⁴ para generar modelos de ratón de cáncer ortotópico y mastectomía de mama. Los objetivos de estos métodos son 1) para imitar la progresión del cáncer de mama humanas y cursos del tratamiento y 2) para llevar a cabo experimentos en vivo con una mayor eficiencia y mayores tasas de éxito en comparación con otros inoculación de cáncer de mama o mastectomía técnicas. En la inoculación de células de cáncer ortotópico, para imitar la progresión del cáncer de mama humano, elegimos la almohadilla de grasa mamaria #2 como un sitio de la inoculación, que se encuentra en el pecho. En la mayoría de los estudios, las células de cáncer de mama son inoculadas por vía subcutánea⁵. Esta técnica no requiere cirugía y por lo tanto, es simple y sencillo. Sin embargo, el microambiente subcutáneo es absolutamente diferente del microambiente de la glándula mamaria, que resulta en la progresión del cáncer diferentes y perfiles incluso molecular^6,7. Algunos estudios usan la glándula mamaria de #4, que se encuentra en el abdomen, como una inoculación sitio⁶. Sin embargo, puesto que las glándulas mamarias #4 se encuentran en el abdomen, el patrón más común de metástasis es carcinomatosis peritoneal⁷, que se produce con menos de 10% de cáncer de mama metastásico⁸. Generados por la técnica presentada aquí, en la glándula mamaria de #2, el cáncer de mama metastatiza en el pulmón, que es uno de los más común cáncer mama sitios metastáticos⁹.

Con esta técnica, el objetivo también es alcanzar una tasa de tumorigenesis con variabilidad de tamaño de tumor mínimo en comparación con otras técnicas de inoculación del cáncer de mama. Para ello, se inoculan células cancerosas suspendidas en una mezcla de proteína gelatinosa bajo visión directa a través de una incisión de la pared de pecho anterior mediana. Esta técnica produce una tasa alta de tumorigenesis con menos variabilidad en el tamaño del tumor y la forma en comparación con la inyección subcutánea o no quirúrgicos, como previamente divulgados^3,7.

También presentamos una técnica de mastectomía radical de ratón en el que el tumor de mama ortotópico es resecado con los tejidos circundantes y los ganglios linfáticos axilares. En el ajuste clínico, el estándar de cuidado para pacientes de cáncer de mama sin enfermedad metástasis distante es mastectomía^10,11. Antes de una mastectomía, metástasis de nodo de linfa axilar es examinada por la proyección de imagen y el centinela biopsia de ganglio linfático. Si no existe evidencia de metástasis ganglionar axilar, el paciente entonces se trata con una mastectomía total o parcial, en la que se omite la resección ganglionar axilar. Mastectomía total es una técnica para extirpar el cáncer de mama con el tejido de la mama en bloque, mientras mastectomía parcial es para resecar el cáncer de mama con un margen de tejido mamario normal, conservando así el tejido mamario normal restante en la paciente. Sin embargo, los pacientes que conservan resto de tejido mamario normal después de una mastectomía parcial requieren radioterapia postoperatoria para evitar la recidiva local¹⁰. Pacientes que tienen metástasis de nodo de linfa axilar mastectomía radical que elimina el cáncer de mama con todo normal se comprometen los ganglios linfáticos tejidos y axilar de la mama e invadieron tejidos en bloque^10,11. En el modelo murino, vigilancia para axilar del nodo de linfa metástasis o en el post-operatorio la radiación no es razonable o factible. Así, utilizamos la técnica de mastectomía radical para evitar la metástasis de nodo de linfa axilar o local.

Inoculación de células de cáncer a través de la vena de la cola es el más frecuente pulmón metástasis ratón modelo¹², la llamada “metástasis experimental”. Este modelo es fácil de generar y no requiere cirugía; sin embargo, no imitar a progresión del cáncer de mama que puede generar un comportamiento diferente de enfermedad metastásica. Con el fin de imitar el curso de tratamiento de cáncer de mama donde la metástasis a menudo se produce después de la mastectomía, se quita el tumor primario después de la inoculación de células de cáncer ortotópico. Esta técnica produce menos recidiva local en comparación con la resección simple del tumor, previamente divulgados¹³y es útil para nuevas terapias, estudios preclínicos y para estudios de investigación de cáncer de mama metastásico. Las técnicas aquí descritas son aplicables para la mayoría mamas cáncer orthotopic modelo de los experimentos. Sin embargo, es importante considerar que la mezcla de proteína gelatinosa puede afectar el microambiente y la cirugía puede afectar la respuesta de estrés inmunitario¹⁴. Por lo tanto, los investigadores estudian el microambiente y/o la respuesta de estrés inmunitario deben ser conscientes de potenciales factores de confusión.

Protocol

Se obtuvo aprobación del Comité de uso y Roswell Park Cancer Center institucional Animal atención integral para todos los experimentos. Nota: Se obtienen nueve a ratones BALB/c hembras de doce semanas de edad. Se utilizan células luc2 4T1, un ratón adenocarcinoma mamario línea celular derivada de ratones BALB/c que ha sido diseñado para luciferase expresa. Estas células se cultivan en medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 10% suero bovino fetal (FBS)…

Representative Results

El propósito del modelo ortotópico es imitar la progresión del cáncer humano (es decir, el crecimiento del tumor primario, seguido por metástasis de ganglios linfáticos y metástasis del pulmón entonces distante)15. Después de la inoculación de células de cáncer, la bioluminiscencia se cuantifica regularmente (dos o tres veces / semana) (figura 1A). La bioluminiscencia en los pulmones es más profundo y más pequeñ…

Discussion

En la última década, hemos venido estableciendo varios modelos murinos de cáncer, incluyendo mama cáncer modelos^{3,7,13,16,20,21}. Previamente, hemos demostrado que mama cáncer células orthotopic la inoculación en el tejido de la glándula mamaria bajo visión directa produce un tumor más grande con menos variabilidad d…

Materials

Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture