Summary
Beta-hücre işlevselliği tek hücreli çözünürlükte kalsiyum akını için genetik olarak kodlanmış bir muhabir kullanarak değerlendirilir kan şekeri homeostazı için önemlidir.
Abstract
Pankreas beta hücreleri artan kan şekeri konsantrasyonları hormon insülin salgılayan tarafından yanıt. Beta hücre fonksiyon bozukluğu hiperglisemi ve ciddi, ölümcül sonuçlara yol açar. Beta hücreleri fizyolojik koşullar altında nasıl çalışır ve ne genetik ve çevresel faktörler onların disfonksiyon neden olabilir anlamak daha iyi tedavi seçenekleri Diyabetik hastalar için neden olabilir. Beta hücrelerinde kalsiyum düzeyleri ölçmek için yetenek kalsiyum iyonları Tetikleyicileri insülin yayın akını olarak beta-hücre işlevi önemli bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. Burada tarif biz zebra balığı beta hücrelerinde glikoz uyarılmış kalsiyum akını GCaMP6s, kalsiyum genetik olarak kodlanmış bir sensör kullanarak izleme için bir iletişim kuralı. Yöntemi hücre içi kalsiyum dynamics ile monte edilmiş ex vivo adacıkları tek hücreli çözünürlükte izleme sağlar. Beta-hücre içinde aynı adacık glikoz yanıt aynı anda farklı glikoz konsantrasyonu altında zebra balığı beta-hücreleri arasında işlevsel heterojenite varlığı öneriyor yakalanabilir. Ayrıca, teknik kalsiyum akını glikoz stimülasyon üzerine salınım doğası ortaya yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü sağlar. Yaklaşımımız zebra balığı beta hücre fonksiyonu ve fonksiyon bozukluğu için genetik ve çevresel faktörlerin katkı araştırmak için bir model olarak kullanmak için kapılarını açıyor.
Introduction
Bizim kan şekeri endokrin pankreas işlev nedeniyle büyük ölçüde dar bir aralıkta tutulur. Endokrin pankreas rolünün hormon salgılayan hücreler içeren adacıkları of Langerhans tarafından gerçekleştirilir. İnsülin salgılayan beta-hücreleri karbonhidrat içeren bir yemek sonrasında kan şekeri düzeylerini azaltmak için sorumludur. Yetersiz insülin salgısı beta-hücre diyabet1sürekli yüksek kan şekeri ile karakterize, neden olabilir. Tip 1 ve tip 2 diyabet, şu anda 400 milyondan fazla insan dünya çapında afflicts, morbidite ve mortalite2için yol açar. Beta-hücre disfonksiyon katkıda moleküler ve çevresel faktörler inceleyerek, biz daha iyi nasıl tip 2 diyabet başlar ve devam eder anlamış oluruz. Buna ek olarak, insan kök hücreleri fonksiyonel beta-hücre vitro ayırt etmek için yetenek cep-yedek terapiler tip 1 diyabet için yeni beta-hücre bir kaynak sağlayabilir. Bu amaçla, çalışma beta hücre fonksiyonu ve olgunlaşma genetik model organizmalarda fonksiyonel beta-hücre içinde bir yemek yapmak için gerekli bilgi elde etmek için önemlidir.
Beta-hücre işlevselliği bütün adacık düzeyinde glikoz-stimülasyon karşılık olarak salgılanan insülin miktarı toplam miktarının tarafından izlenebilir. Bu toplu yaklaşım adacık hücreleri tek bir grup bir hücrenin bireysel özellikleri ayırt olmadan çalışmaları. Ancak, glikoz yanıt bireysel beta-hücre Analizi fonksiyonel özellikleri beta-hücre ve heterojenlik3varlığı bir çeşitlilik ortaya koydu. Işlev bireysel beta-hücre değerlendirmek için insülin salgısı4' e kurşun hücre içi değişiklikleri izlemek mümkündür. İnsülin salgılanması beta hücrelere glikoz girişlerin önce gelmelidir. Beta hücrelerinde girer glikoz ATP için hızla metabolize. Yüksek hücre içi ATP konsantrasyonları beta-hücre depolarizasyon için önde gelen ATP duyarlı potasyum iyon kanalları açık olasılığını azaltın. Depolarizasyon voltaj duyarlı kalsiyum iyon kanalları açılır ve hücre içi kalsiyum artar. Buna karşılık, kalsiyum ekzositozu insülin, dolaşımda piyasaya sürülen glikoz-kullanımı5,6,7teşvik ederek şekeri düşürür tetikler.
Işlev beta-hücre membran potansiyel8, insülin-veziküller ekzositozu9doğrudan görselleştirme ve miktar intrasellüler Ca+ 2 izleme dahil olmak üzere, araştırmak için uygulanan çeşitli stratejileri akın glikoz-yanıt verme hızını10için bir proxy gibi. Bunlar arasında yukarı ölçekleme-glikoz-yanıt arasında doğrudan karşılaştırma için izin aynı adacık11,12, birden fazla bireysel hücrenin analiz avantajı intrasellüler Ca2 + görüntüleme sağlar bireysel beta-hücre. İntrasellüler Ca2 + konsantrasyonu kalsiyum duyarlı floresan boyalar13 ya da genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (turk)14aracılığıyla izlenebilir. Oysa kalsiyum-gösterge boyalar olmaması hücre tipi özgüllük, Turk belirli hücre tipinde belirli rehberleri tarafından ifade edilebilir. Ayrıca, Turk, GCaMP6 gibi yeni nesil ile birlikte daha hızlı zamansal dinamiği15daha iyi sinyal-gürültü oranı sağlar. Burada biz yeni-nesil Turk, beta-hücreleri tek hücre çözünürlükte kalsiyum görselleştirmek için belirli GCaMP6s yardımcı programı tanımlamak. Zebra balığı birincil adacık seçim bizim model olarak bu yöntemi uygulamak. Embriyonik gelişim sırasında beta-birincil adacık hücrelerde sırt--dan kaynaklanan ve ventral pankreas16tomurcukları. Birincil adacık klişeleşmiş bir anatomik pozisyonda onun kolay tanımlanması ve yalıtım etkinleştirme zebra balığı pankreas içinde yer alır. Onların genetik ablasyon hiperglisemi17,-18yol açar gibi beta-birincil adacık hücrelerinde glikoz-yönetmelik için gereklidir. Ayrıca, bu beta hücreleri sırasında erken zebra balığı geliştirme19glikoz duyarlı olmak. Bu protokol sonrası embriyonik evrelerinde formu ikincil adacıkları Imaging'e da uygulanabilir. Protokol için görüntü beta hücreleri ex vivo, daha sonraki aşamalarında gelişme ve altında tanımlanmış glikoz konsantrasyonu sağlar.
Protocol
Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamlar tarafından hayvan refah Yasası ve Landesdirektion Sachsen, Almanya (AZ 24-9168.11 / 1/2013 / 14, T12/2016) izniyle onaylanmış olması.
1. hazırlık
Not: Bu zebra balığı birincil adacık Çift Kişilik transgenik Tg den ex vivo görüntüleme için protokolüdür (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebra balığı. Transgenik bu satırda, insülin organizatörü (INS) Sürücüler iki transgenes beta-hücre belirli ifade: nls-Renilla-monomeric Kusabira orange 2 (mKO2) ile beta hücrelerinin çekirdeği işaretler mKO2 floresan; ve GCaMP6s15, hücre içi kalsiyum düzeyleri artırmak için yanıt yeşil floresans yayar. GCaMP6s beta hücre özel ifade glikoz-yanıt beta-hücre hücre tipleri çevreleyen kalsiyum değişiklikler müdahalelerden olmadan eğitim sağlar.
- 10 mg Ca2 +/Mg2 +1 ml sığır fibrinojen çözülerek taze fibrinojen stok (10 mg/mL) hazırlamak-bir 1,5 mL santrifüj tüp Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) içeren. Şiddetle fibrinojen tozu tamamen eriyene kadar girdap. Çözüm, oda sıcaklığında en az 15 dakika daha devam et.
Not: Eğer çözüm polimerize başlar ve viskoz hale gelir stok, oda sıcaklığında 2-3 h. atma hisse senedi için tutulabilir. - Fibrinojen çalışma çözüm (3.3 mg/mL) fibrinojen hisse senedi sulandrarak üç kat içinde HBSS hazırlayın. Örneğin, HBSS fibrinojen çalışma çözüm 900 µL hazırlamak için 600 µL fibrinojen stokunun 300 µL karıştırın.
- Trombin çözüm (10 U/mL) 10 çözülerek hazırlamak Trombin HBSS veya fosfat 1 ml birimlerinin tamponlu tuz (PBS).
Not: Bu çözüm olabilir önceden, 50 µL bölümlerinde bölünmemeli hazır ve -20 ° C'de dondurulmuş - 200 mM D-glikoz çözüm D-glikoz 1.8 g 50 mL su içinde çözülerek hazırlayın. Uzun süreli depolama için 4 ° C'de tutun.
- 300 mM KCl çözüm KCl 1.1 g 50 mL su içinde çözülerek hazırlayın. Uzun süreli depolama için 4 ° C'de tutun.
- 35 mm çapında cam alt yemekleri adacıkları montaj için temin etmek.
- Floresan lamba ve kırmızı filtre küp ile donatılmış stereo mikroskop diseksiyon ve adacık montajı için kullanın (TRITC: uyarma: 532-554 nm, emisyon: 570-613 nm; ya da Teksas kırmızı: uyarma: 540-580 nm, emisyon: 592-667 nm).
- Kalsiyum akını bir ters confocal mikroskobu (Zeiss LSM 780 veya benzer) 20 (0.8 NA) X hava amaç ve 35 mm çapında cam alt yemekler için bir plaka sahibi ile donatılmış kullanım beta hücrelerindeki görüntüleme için.
- Zebra balığı ötenazi için tricaine Metan Sülfonat (MS222) 200 mg/L çözeltisi hazırlamak.
- 90 mm Petri yemekler zebra balığı diseksiyon için tedarik.
2. zebra balığı İlköğretim adacık diseksiyon ve montaj
- Uzun süreli kuluçka MS222 içinde kullanarak bir balık ötenazi. Bunun için yavaşça akvaryum balık ağı kullanarak balık çıkartın ve hiçbir opercular (solungaçları) hareket hayvan gösterir kadar MS222 solüsyon içeren bir kabında kuluçkaya; Genellikle, bu alır 5 dk. ile Ca2 +/Mg2 +HBSS solüsyon içeren bir petri balık aktarmak.
-
Bir floresan lamba ve kırmızı filtre küp ile donatılmış bir stereo mikroskop altında sağ tarafındaki pankreas yalıtmak için hayvanın karın kapsayan cilt incelemek.
- Bunun için ağzından çıkan zebra balığı anal yüzgeç keskin forseps kullanarak için deriyi kesme. Karın ortaya çıkarmak için kesme cilt soyma uzakta; Bu ekran alıntısı iç organlar ortaya koyar. Beta-hücre içinde kırmızı floresans mKO2 ifade kullanarak, mikroskop altında görsel muayene tarafından adacıkları konumunu tespit. Adacık idare eder gibi karaciğer lobları kaldırmanız gerekirse, bulmayı zorlaştırır.
Not: Birincil adacık sağ tarafında genellikle karın ön bölge yakınında yer alır.
- Bunun için ağzından çıkan zebra balığı anal yüzgeç keskin forseps kullanarak için deriyi kesme. Karın ortaya çıkarmak için kesme cilt soyma uzakta; Bu ekran alıntısı iç organlar ortaya koyar. Beta-hücre içinde kırmızı floresans mKO2 ifade kullanarak, mikroskop altında görsel muayene tarafından adacıkları konumunu tespit. Adacık idare eder gibi karaciğer lobları kaldırmanız gerekirse, bulmayı zorlaştırır.
- Birincil adacık dikkatle karaciğer ve adiposit gibi çevreleyen doku kaldırarak temizleyin. Yaralama veya adacık poke için önlem almak; çevreleyen doku temizledikten sonra tek tek hücreleri adacık yüzeyinde discernable haline.
- HBSS merkezi bir cam alt tabak üzerine bir 30 µL damla pipette. Disseke adacık için bu açılan aktarın.
- Dikkatle adacık HBSS ile bir kez ve bir kez 30 µL fibrinojen çalışma çözüm (3.3 mg/mL) ile yıkayın. Çünkü aksi halde hücre ölümünde sonuçlar Ada'lardan biri çamaşır adımları uyguladığınızda kurutma önlemek emin olun.
- Yavaş ve nazikçe 10 µL Trombin çözüm (10 U/mL) ekleyin. Adacık ve çanak 15-20 dk. fibrinojen-Trombin açılan bu noktada viskoz ve biraz opak olacak gözlemlemek için el değmemiş bırakın.
3. Ex Vivo canlı görüntüleme, zebra balığı İlköğretim adacıkları GCaMP floresan yoğunluğu
- HBSS 200 µL üstünde tepe-in kalıp ekleyin ve çanak dikkatle confocal mikroskop plaka sahibi yerleştirin. 20 X, 0.8 NA, hava amaç confocal görüntüleme için kullanın. Aydınlık alan seçeneğini kullanarak adacık bulun.
- Kırmızı floresans için filtre kullanarak nükleer mKO2 floresan beta-hücre içinde görüntülemek için adacık üzerinde odaklanmak. Bireysel çekirdeği açıkça görünür olmalıdır.
- NET görüntüleme uçağa el ile onun z ekseni boyunca adacık kalınlığı hareket böylece confocal mikroskop odak düzlemi değiştirerek bulun. Beta-hücre görüntüleme için yeterli sayıda (50-100) görüntüleme uçak içerir ve nükleer mKO2 floresan parlaklığını özellikle adacık ortasında tek tip, olduğundan emin olun.
- GCaMP6s ve mKO2 floresan "Akıllı ayarlar menüsünde" aşağıdaki ayarları kullanarak sıralı edinmesinin ayarlayın: GCaMP6s, uyarma: 488 nm, emisyon: 500-555 nm, yanlış-renk: yeşil (Select "GFP"); mKO2, uyarma: 561 nm (mCherry), emisyon: 570-630 nm, yanlış-renk: kırmızı (Select "mCherry").
Not: yeşil kanal GCaMP floresan yoğunluğu kaydederken bu ayar, kırmızı kanal beta-hücre çekirdeği, konumunu kaydeder. - "Satın alma" görüntü çözünürlüğü 1024 x 1024 piksel çözünürlükte modunda, 10 ve 1'de ortalama hız. "Zaman serileri" seçeneğini seçip kare başına yaklaşık 2 s edinme zamanla 500 döngüsü "süresi" ayarı Başlat sürekli kayıt.
Not: Saat serisi ilk 50 kare 5 mM glikoz konsantrasyonu, beta hücrelerinin etkinliği karşılık gelir. Bu temel yanıttır. Bir yanıt veren beta-hücre ağda ve yeşil floresan yoğunluğu zaman ile zayıflayan gösterir. Biz bir kaç (1 – %5) beta-hücre 5 mM glikoz salınım gözlemledim. -
Gözün üzerinde görüntüleme döngüsü. İlk 50 kare sonra kaydı durdurmadan 10 mM çevreleyen çözümü glikoz konsantrasyonu artırmak.
- Yavaşça 200 mm D-glikoz çözüm adacık tutan jel üstüne 5 µL pipet resim alma perturbing olmadan. 10 mM glikoz 150 kare elde etmek.
Not: Glikoz konsantrasyonu artış beta-hücre sayısı artacak GCaMP floresan salınımlarını yeşil kanal içinde geçiyor. - Hücre çekirdeği işlemi sırasında kararlı kalmasını sağlamak. Adacık yaygın olarak satın alma sırasında titriyor ve çekirdekleri odak düzlem dışında hareket ediyor, örnek (gerekirse) atmak.
- Sonraki örnekleri istikrarı sağlamak amacıyla polimerizasyon fibrinojen-Trombin kalıp etkinleştirmek için yeterli bir süre beklemeniz.
- Yavaşça 200 mm D-glikoz çözüm adacık tutan jel üstüne 5 µL pipet resim alma perturbing olmadan. 10 mM glikoz 150 kare elde etmek.
- 200 kare, yavaşça 200 mm D-glikoz çözüm 10 µL pipetting tarafından 20 mm çözüm konsantrasyonu daha da artırmak. 20 mM konsantrasyon için 150 kare elde etmek.
- 350 çerçeveler sonra KCl 30 mM kullanarak adacık depolarize. Bunun için 20 µL 300 mm KCl hisse senedi çözüm ekleyin. Bu aşamada GCaMP6s floresan salınımlarını durdurmak ve yüksek yoğunlukta düzeltmek gözlemlemek; glikoz için yanıt vermedi Beta hücreleri de bir artış yeşil-floresan yoğunluğu üzerine KCL ek olarak görüntülenebilir.
4. GCaMP floresans izleme bireysel Beta-hücre için miktar
Not: izleme ve glikoz düzeyleri değişen bireysel beta-hücre yanıtları ölçmek için tüm görüntüleme döneme ait GCaMP floresan yoğunluğu ölçmek. Miktar hücresel çözünürlükte gerçekleştirilir. Bunun için FIJI20 görüntüleri (adım 4.1-4,6) ve elektronik tablo yazılımı veya çözümleme (adım 4,8-4,9) yapmak için R21 GCaMP floresan yoğunluk değerleri ayıklamak için kullanın.
- Resim dosyasının "LSM Toolbox" kullanarak FİJİ'de açın. Bunun için seçin "eklenti | LSM araç kutusu | LSM araç kutusunu göster". "LSM araç", "Açık LSM" tıklayın ve görüntü dosyasını seçin.
Not: "LSM Toolbox" tarafından desteklenmeyen biçimler için onlara ilk analiz için TIFF dönüştürün. - Fiji'de faiz bölge (ROI) aracını kullanarak hücre yanıt-e doğru hulâsa. "Analiz" menüsünde "Araçlar" altında "ROI Yöneticisi" açın. Yatırım getirisi "çokgen seçim aracını araç çubuğunda bulunan" kullanarak el ile çizin.
- ROI beta-hücre çekirdekleri görülebilir kırmızı kanalı çizin. Öyle ki bazı hücrenin sitoplazma eklemek için bir hücrenin çekirdeği büyük olan bir alanı kaplamaktadır ROI seçin. Yatırım getirisi pozisyon çerçeveler arasında tutarlı olduğundan emin olun ve konumu ayarlayın.
- Seçili ROIs "Ekle [t]" butonuna basarak "ROI Yöneticisi" ekleyin. Seçin ve birden çok hücre verilerini elde etmek için yatırım getirisi için birden fazla ROIs ekleyin.
- Sonra "Analiz" menüsünden "ölçümleri kümesi" seçin. "Entegre yoğunluk" Toplam floresan yoğunluğu alanı içinde çıkarımı belirtmek için seçin.
- GCaMP floresan içeren yeşil kanalı vardiya ve "ROI Yöneticisi'nde" "Multi ölçü" seçin.
Not: Bu hücreler boyunca zaman serileri için yoğunluk ölçümleri sağlayacaktır. - Yatırım getirisi pozisyon adacık hareketi nedeniyle ayarlanması durumu, el ile farklı karelerdeki yoğunluk ölçümleri derleyin. Kopyalayabilir ve değerleri ayrı bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.
- Görüntü kareleri zaman damgaları "LSM araç kutusundan" elde edilir. Kullanım "uygulamak pullar | T pulları uygulamak | Dosya adı | Zaman damgalarını elde etmek için textfile dökümü". "Farklı kaydet" seçeneğini kullanarak zaman damgaları kaydedin veya elektronik tabloya kopyalayın.
- Yoğunluk değerleri tüm hücreler için derleme üzerine analiz bir hücre bir zamanda veya otomatik olarak (Excel formülleri veya R kullanarakÖrneğin,) gerçekleştirin.
-
Tek tek hücreleri iki adımda analiz.
- İlk adımda, temel yukarıda floresan yoğunluğu hesaplayabilirsiniz. Bu amaçla, temel floresan yoğunluğu (F0) Floresan yoğunluklarını ilk 50 kare (5 mM glikoz) için Ortalama olarak hesaplayın. Tüm zaman serisinden temel (F0) çıkarma (F-F0).
Not: bir kaç hücre genellikle daha yüksek konsantrasyonları ile stimülasyon takip devam açık GCaMP titreşimler bazal glikoz altında gösterebilirsiniz. Böyle hücreler için yalnızca F0 ortalama yoğunluğu içinde bir damla içinde floresan hücreleri gösterdi ilk kare alarak tahmin etmek mümkündür. - Analiz ikinci adımda, floresan yoğunluğu normalleştirme tarafından son GCaMP floresan yoğunluğu elde etmek.
Not: Bu adacıkları farklı hayvanlardan arasındaki farklar kaldırmak için gerçekleştirilir. Bireysel adacıkları floresans emisyon glikoz stimülasyon üzerine çeşitli düzeylerde görüntüler. - Floresan yoğunluğu en yüksek yoğunluk değeri ile bölerek normalize. Bunun için en yüksek yoğunluk (Fmax -F0) hesaplamak ve son GCaMP floresan yoğunluğu verimi en yüksek yoğunluk tarafından düşülen temel değerleri bölmek (F-F0) / (Fmax -F0).
- İlk adımda, temel yukarıda floresan yoğunluğu hesaplayabilirsiniz. Bu amaçla, temel floresan yoğunluğu (F0) Floresan yoğunluklarını ilk 50 kare (5 mM glikoz) için Ortalama olarak hesaplayın. Tüm zaman serisinden temel (F0) çıkarma (F-F0).
- Sağlıksız veya bozuk olabilir gibi bir değişiklik KCl stimülasyon, takip şiddeti sergi değil hücreleri atın.
- R (adım 4,9-4.10) analiz gerçekleştirmek için kullanma R el yazısı (plotcelltrace. R) Bu el yazması ile sağlanan.
Representative Results
Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, bir 45 gün sonrası döllenme (dpf) zebra balığı bir adacık beta-hücrelerin glikoz tepkiler analiz edildi. Bunun için birincil adacık euthanized bir hayvandan disseke ve fibrinojen-Trombin kalıp cam alt çanak içine monte. Adacık 5 mM glikoz içeren HBSS dalmış. Glikoz konsantrasyonu 10 mM ve 20 mM step-wise bir şekilde arttı. Beta hücreleri yanıt artan şekeri konsantrasyonları kaydedildi. Son olarak, beta hücreleri 30 mM KCl (Şekil 1) kullanarak depolarized. KCl kullanarak depolarizasyon sağlıklı beta-hücre girdisinde kalsiyum neden olmaktadır.
FIJI ve veri analiz yazılımı kullanarak, bireysel beta-hücre GCaMP6s floresan yoğunluğu elde edilir ve (Şekil 2) normalleştirilmiş. Floresan yoğunluğu izleme görüldüğü gibi bireysel beta-hücre salınım GCaMP6s floresan KCl stimülasyon durur glikoz stimülasyon üzerine görüntülemek. Teknik hücresel çözünürlüğe beta-hücre glikoz-yanıt ve bir pencere onların işlevselliği sağlar.
Resim 1: Ex vivo canlı görüntüleme, zebra balığı beta hücrelerinde GCaMP6s kullanarak kalsiyum akını. Birincil bir adacık Tg(ins:nls-Renilla-mKO2) üzerinden; TG(ins:GCaMP6s) zebra balığı (45 dpf) fibrinojen-Trombin kalıp içinde monte ve 5 mM (bazal) glikoz ile inkübe. GCaMP6s floresan yeşil kanal mevcut iken beta hücreleri kırmızı bir nükleer marker ile etiketlenmiş. Adacık sıralı kuluçka 10 mM ve 20 mM D-glukoz ile oluşan bir glikoz rampa ile uyarılmış ve 30 mM KCl. ok uçları olan faaliyet analiz edildi bireysel beta hücreleri işaretlemek ilavesi ile depolarized. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: GCaMP6s floresan yoğunluğu-izleme bireysel beta-hücre için normalleştirilmiş. Normalleştirilmiş GCaMP6s floresan yoğunluğu izleme Şekil 1' deki ok uçları ile işaretli beta hücreleri için. X ekseni süreyi saniye olarak gösterir. Üst kısmında, glikoz ve KCl konsantrasyon HBSS orta barlar tasvir. Y ekseni normalleştirilmiş floresan yoğunluğu sırasında saat serisi gösterir. Bunun için temel yoğunluğu (F0) ortalama yoğunluğu 5 mM glikoz kuluçka sırasında hesaplanır. Bu tüm zaman serisi veri--dan çıkarılır (F - F0). Yoğunluğu üzerinde temel hücre tarafından görüntülenen maksimum yoğunluk tarafından normalize (F - F0) / (Fmax- F0). Normalleştirilmiş izleme hangi hücreleri 30 mM KCl. depolarized zaman stabilize glikoz, beta-hücre salınım bir tepki gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Burada biz bir teknik beta-hücre glikoz yanıt tek hücreli çözünürlükte miktar için göstermek. Bu bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi, GCaMP6s kullanarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu izleyerek mümkün olmaktadır. Beta-hücre etkinliği yakalanan ex vivo yanında adacık fibrinojen-Trombin kalıp montaj olduğunu. Kritik bir iletişim kuralının kalıp kararlılığını adımdır. HBSS çözüm içinde çözülmeye fibrinojen için verilecek yeterli zamana ihtiyacı var. Bu olmadan, kalıp yeterince görüntüleme oturumu sırasında istikrar sağlamak için polimerize değil. Fibrinojen-Trombin kalıp içinde monte ve hücre kültür medyada dalmış bir adacık en az bir hafta (veri gösterilmez) canlı kalabilir. Fibrinojen-Trombin kalıp, düşük-melt özel gibi alternatifler adacık22takmak için yararlı olabilir. Başka bir kritik adacık diseksiyon parametresidir. Bu adım sırasında adacık çevreleyen doku yaralanmasına veya adacık alay olmadan kaldırılması gerekiyor. Usta bir diseksiyon uygulama ile geliyor.
Adacık bir confocal uçak için kısıtlama görüntüleme protokolü sınırlamasıdır. Bu bireysel beta-hücre içinde kalsiyum akını dinamikleri yakalamak için yapılır. Z yığınında adacık tüm kalınlığı düşük görüntüleme hızı ve tek tek hücreler salınım sinyal kaybına yol açar. Bu sınırlama 3-boyutlu kalsiyum dynamics yakalama etkinleştirmek için confocal-görüntüleme gibi dönen disk mikroskobu, daha hızlı yolları kullanarak gelişmiş olabilir. Başka bir sınır içinde vivo kalsiyum görüntüleme12olur. Zebra balığı embriyo şeffaf yapısı veya zebra balığı yetişkin23 suşları pigment daha az kullanımı gelecekte vivo içinde görüntüleme için olasılığını açılabilir.
Bireysel beta hücreleri arasında işlevsel heterojenite araştırmak için beta-hücre aktivitesi yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntüleme sağlar. Bu yaklaşım beta-hücre alt nüfus varlığı ışık yardımcı olur. Son zamanlarda, birden fazla çalışmalar içinde sözde homojen beta-hücre24,25,26alt nüfus varlığını göstermiştir. Ex vivo görüntüleme genetik gazeteciler glikoz için alt halkın yanıtının karakterize için birleştirilebilir. Buna ek olarak, görüntüleme Kur farmakolojik stimülasyon ile birleştirerek beta-hücre işlevselliğini artırabilirsiniz bileşiklerin tarama için izin verebilirsiniz.
Özetle, burada sunulan tekniği miktar ve bireysel beta hücreleri glikoz yanıt karşılaştırmasını sağlar. Beta-hücre işlevselliği, diyabet gelişiminde önemli bir parametre içine doğrudan bir pencere sağlar.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Ninov laboratuvar Yorumlar için üyeleri üzerinde el yazması, Merkezi üyeleri rejeneratif terapiler Dresden (CRTD) balık ve mikroskopi tesisi için teknik yardım için teşekkür ediyoruz. N.N. DFG-CRTD, küme mükemmellik TU-Dresden, Alman Araştırma Vakfı (DFG) ve Alman merkezi diyabet araştırma (DZD) için fon tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
| Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
| Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
| Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
| Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| 35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
| tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
| FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
| R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
| RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
| plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |
References
- Kahn, S. E. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).
- Ogurtsova, K., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).
- Pipeleers, D. G.
- MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P.
- Hellman, B., et al. Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells. Diabetologia. 37, Suppl 2. S11-S20 (1994).
- Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets. J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).
- Wollheim, C. B., Pozzan, T. Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line. J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).
- Pace, C. S., Price, S. Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli. Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).
- Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release. J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).
- Soria, B., Martin, F. Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).
- Kenty, J. H. R., Melton, D. A. Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression. PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
- Friedman, R. S., et al. An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function. Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nat Commun. 7, 11756 (2016).
- Johnston, N. R., et al. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose. Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).
