小鼠经常尾端采血对脉动性促黄体激素分泌的评价
Summary
在这里, 我们提出了一个尾巴尖端血液取样协议, 以频繁样本收集在无约束的小鼠。该方法对评估脉动性促黄体激素分泌模式有一定的参考价值, 可用于其他循环因素的分析。
Abstract
在许多内分泌系统中, 循环因子或荷尔蒙不会连续释放, 而是作为一种离散的脉搏分泌, 以响应释放因子。单点取样措施不足以充分理解正常生理条件下或失调条件下脉动激素分泌模式的生物学意义。促黄体激素 (LH) 是由垂体前 gonadotrope 细胞合成的, 在脉动模式下分泌, 需要经常采集血液样本进行脉搏评估。这是不可能的, 直到最近, 由于开发了高灵敏度 LH 检测和先进的技术, 频繁的低量样本收集, 最初描述的 Steyn 和同事。1在这里, 我们描述了一个协议, 从小鼠频繁的外周血标本收集, 充分的处理驯化, 以检测 LH 的脉动分泌。目前的协议详述了一个扩大的驯化期, 允许评估的健壮和连续脉冲的 LH 在多个小时。在这个协议中, 尾巴的尖端被修剪, 血液是从尾部收集使用手持吸管。为了评估 gonadectomized 小鼠的搏动性 LH, 每隔5-6 分钟收集一系列样品, 90-180 分钟. 重要的是, 在清醒、自由行为的小鼠体内, 采集血液和测定 lh 的健壮脉冲, 给予适当的处理驯化和努力, 以尽量减少环境压力。在采血前4-5 周内可以达到足够的驯化。本议定书强调了方法的进展, 以确保收集全血样本, 以评估在老鼠的多小时内脉动 LH 分泌模式, 一个强大的动物神经内分泌研究模型。
Introduction
哺乳动物性腺功能依赖于促性腺激素分泌, 促黄体激素 (LH) 和卵泡刺激激素, 从垂体腺。促性腺激素是以脉动或浪涌模式分泌促性腺激素释放荷尔蒙 (促性腺素) 的下丘脑分泌物。LH 和 FSH 的合成和分泌都是通过内分泌、分泌和分泌作用来调节的, 包括下丘脑促性腺激素、性腺激素和激活-抑制素-卵泡抑素系统, 以及无数包括应力和能量平衡在内的生理条件。2
lh 在血液中的脉动模式产生于一个相当突然的 lh 放电到外周血, 其次是近似指数消除。该模式的重要特征包括每个 lh 放电的频率和 lh 反应的振幅, 这两者都是由释放促性腺激素. 由于收集下丘脑-垂体门血的困难, 测量搏动性促性腺激素, LH 的取样和测量被用来作为促性腺激素调节下丘脑-垂体-性腺轴的代表。因此, 关键信息编码的频率和幅度的 LH 脉冲, 这不能确定从一个单一的样本。
对搏动性 LH 分泌物的分析历史上仅限于大型哺乳动物 (人类、灵长类动物和绵羊), 原因是它们的血容量大, 而且对频繁的血样采集有耐受性。在啮齿动物中, 频繁的血液取样仅限于大鼠, 通过留置心房导管实现。3,4相对较低的遗传成本和可用性 (例如, CRISPR) 和复杂的神经回路 (如光遗传学、chemogenetics) 操作使小鼠成为具有吸引力的模型有机体;然而, 获得频繁的血液样本和随后的 LH 浓度分析, 直到最近, 证明是难以捉摸的。这项艰巨的任务是由 Steyn 和同事开创的。1从那以后, 几个实验室已经开始使用频繁的血液取样和超敏 lh 检测, 以评估脉冲 LH 分泌物在各种实验范式。5,6,7,8,9应指出的是, 寻求一种实用的方法来收集来自小鼠的多份血样已经进行了至少40年的10 , 并进行了多次改良。11,12
对 LH 脉冲模式 (即频率和振幅) 的评估, 是监测这种遗传听话动物模型中的基础促性腺激素分泌的一个重要的改进。传统上, 小鼠的 LH 浓度在单个血液样本中测定。单点样本的一个缺点是高度可变的数据集, 因为 LH 浓度在每个脉冲期间自然波动。另一个缺点是, 孤立的测量本身就忽略了 LH 脉冲分泌模式所传达的关键信息。因此, 在自由行为, 无约束的小鼠收集频繁的血液样本 (除了在取样过程中温和处理) 的方法将提供增强的信息, 并证明有用的许多实验室研究搏动激素调节。
在这里, 我们描述了一个协议, 收集频繁 (每6分钟) 血液样本从清醒, 无拘无束的老鼠。重要的是, 我们包括一个处理习得协议, 允许强健和连续检测脉冲 LH 分泌物在整个血液样本收集的时间内, 对急性挑战的前期和事后评估可以确定,如对固定化和克制的社会心理压力的反应。对全血标本 LH 浓度进行了有效的测定;1本协议的重点是收集血液样本的 LH 脉冲测量方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个经常性的血液收集的全血尾端样本, 以评估脉冲 LH 分泌的小鼠的协议。该协议可以收集样本, 以检测在受心理社会压力照射后搏动性 lh 分泌物的急性变化, 并且很适合在其他急性或慢性操作下对 lh 脉冲进行评估。
该协议的关键组成部分, 以实现可靠和健壮的 LH 的配置文件是处理驯化期。在文献中推测, 处理压力会损害激素分泌的想法在17</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢 Drs. 珍妮弗. 杨和亚历山大 (萨沙) 考夫曼为技术协助与这项技术并且许多有用和关键的讨论。血清激素测定是由2017在弗吉尼亚大学的生殖配体检测和分析核心研究中心进行的, 由尤尼斯肯尼迪发育研究院/NIH (NCTRI) 赠款 P50-HD28934 支持。
研究支持来源: R01 发育研究院 86100 (九巴), 成果管理制得到 T32 发育研究院007203的支持。
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
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