Fréquente la queue-extrémité prélèvements chez les souris pour l’évaluation de la sécrétion de l’Hormone lutéinisante Pulsatile
Summary
Nous présentons ici un protocole de prélèvement de sang de la queue-extrémité pour prélèvement fréquents chez les souris sans retenue. Cette méthode est utile pour évaluer des modèles de la sécrétion pulsatile de LH et pourrait être adaptée pour l’analyse d’autres facteurs circulants.
Abstract
Dans de nombreux systèmes endocriniens, des hormones ou des facteurs circulants ne sont pas libérés de façon continue, mais sont sécrétées comme une impulsion discrète en réponse à un facteur de libération. Seul point d’échantillonnage mesures sont insuffisantes pour comprendre pleinement la signification biologique du modèle sécrétrice d’hormones pulsatiles soit dans des conditions physiologiques normales, soit en cours de dérégulation. L’hormone lutéinisante (LH) est synthétisée par les cellules de gonadotrope hypophysaire antérieure et sécrétée de façon pulsatile qui nécessite de fréquent collecte d’échantillons de sang pour évaluation de l’impulsion. Cela n’a pas été possible chez la souris jusqu’à ce que récemment, grâce au développement d’un test de LH ultrasensible et avancement dans une technique de fréquentes de prélèvement d’échantillons de faible volume, initialement décrit par Steyn et ses collègues. 1 nous décrivons ici un protocole pour le prélèvement de sang périphérique fréquents de souris avec l’acclimatation de manipulation suffisantes pour détecter la sécrétion pulsatile de LH. Le protocole actuel détaille une période d’acclimatation élargie qui permet de mesurer les impulsions robustes et continues de LH depuis plusieurs heures. Dans ce protocole, l’extrémité de la queue est coupée et le sang est recueilli de la queue à l’aide d’une pipette à main. Pour l’évaluation de type pulsatile LH chez la souris gonadectomized, échantillons de la série sont recueillies toutes les 5-6 min pour 90-180 min. ce qui est important, la collecte de sang et de la mesure des impulsions robustes de LH peuvent être accomplis en souris éveillés, librement de comportement anormal, étant donnés la manipulation adéquate acclimatation et des efforts pour minimiser les facteurs de stress environnementaux. Acclimatation suffisante peut être réalisée dans les 4-5 semaines ayant précédé le prélèvement de sang. Ce protocole met en évidence les progrès dans la méthodologie afin d’assurer la collecte d’échantillons de sang pour mesurer les patrons de sécrétion pulsatiles LH depuis plusieurs heures chez la souris, un modèle animal puissant de recherche neuro-endocrines.
Introduction
Fonction des gonades chez les mammifères est dépendante de la sécrétion de gonadotrophine, hormone lutéinisante (LH) et folliculostimulante hormone de l’hypophyse. Les gonadotrophines sont sécrétées en soit un modèle pulsatile ou surtension en réponse à la sécrétion hypothalamique de la gonadolibérine (GnRH). La synthèse et la sécrétion de LH et FSH sont réglementés par une action endocrine, paracrine et autocrine d’une variété de molécules dont GnRH hypothalamique, hormones stéroïdes gonadiques et le système de l’activine-inhibin-follistatine, mais aussi une myriade de conditions physiologiques, y compris l’équilibre énergétique et de stress. 2
Le modèle pulsatile de LH dans le sang provient plutôt brusque décharge de LH dans le sang périphérique, suivi par environ exponentielle élimination. Important du modèle comprennent la fréquence de chaque décharge de LH et l’amplitude de la réponse de la LH, qui sont dictées, en partie, par la libération de GnRH. Due à la difficulté dans la collecte de sang portal hypothalamo-hypophysaire pour la mesure de GnRH pulsatile, l’échantillonnage et la mesure de LH est utilisé comme un proxy pour règlement de GnRH de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique. Donc, information critique est codée de la fréquence et l’amplitude des impulsions de LH, ce qui ne peut être déterminée à partir d’un seul échantillon.
Analyse de la sécrétion pulsatile de LH a toujours été limitée aux grands mammifères (moutons, les primates et les humains) en raison de leur volume sanguin important et la tolérance pour le prélèvement d’échantillons sanguins fréquents. Chez les rongeurs, les prélèvements sanguins fréquents se limitait au rat et atteint via oreillette cathéter à demeure. 3 , 4 le coût relativement faible et la disponibilité des ressources génétiques (par exemple , le cre-lox, le CRISPR) et des manipulations des circuits neuronaux complexes (p. ex. optogenetics, chemogenetics) faire des souris un organisme modèle attrayant ; Cependant, réalisation d’échantillons sanguins fréquents et l’analyse ultérieure des concentrations de LH a jusqu’à récemment, prouvé insaisissables. Cette tâche monumentale a été mis au point par Steyn et ses collaborateurs. 1 depuis lors, plusieurs laboratoires ont commencé à utiliser les prélèvements sanguins fréquents et ultra-sensible des dosages de LH pour évaluer la sécrétion pulsatile de LH dans une variété de paradigmes expérimentaux. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 il convient de noter que la poursuite d’une méthode pratique de rassembler plusieurs échantillons de sang des souris a été en cours pendant au moins 40 ans10 avec plusieurs perfectionnements réalisés le long du chemin. 11 , 12
Évaluation des modèles d’impulsions LH (c’est-à-dire la fréquence et l’amplitude) représente une amélioration majeure dans le suivi de la sécrétion de gonadotrophine basale dans ce modèle animal génétiquement tractable. Traditionnellement, les concentrations de LH chez la souris ont été déterminées dans un échantillon sanguin. Une faiblesse d’échantillons monopoint est un ensemble de données très variable, parce que les concentrations de LH sont naturellement fluctuant au cours de chaque impulsion. Une autre faiblesse est que les mesures isolées manquer intrinsèquement critique information véhiculée par les patrons de la sécrétion de LH impulsion. Ainsi, une méthode de collecte des échantillons de sang fréquents en comportement librement, souris sans retenue (à l’exception de la manipulation douce lors de l’échantillonnage) fournira informations améliorées et s’avérer utiles à de nombreux laboratoires enquêter sur règlement hormone pulsatile.
Nous décrivons ici un protocole pour la collecte de fréquents (toutes les 6 min) des échantillons provenant de souris éveillés, sans retenue de sang. Ce qui est important, nous incluons une manipulation protocole d’acclimatation qui permet pour détection robuste et continue des sécrétion pulsatile de LH dans les échantillons de sang entier recueillies pendant un laps de temps où, avant et après l’évaluation à une stimulation aiguë peut être déterminé, comme la réponse au stress psychosocial d’immobilisation et de retenue. Un test efficace pour les concentrations de LH provenant d’échantillons de sang entier a été décrit précédemment ; 1 le présent protocole est axé sur une méthode pour rassembler les échantillons de sang pour une mesure du pouls LH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole de prélèvement de sang fréquents des échantillons de sang total queue-extrémité pour l’évaluation de la sécrétion pulsatile de LH chez la souris. Ce protocole permet le prélèvement d’échantillons pour la détection des changements aigus dans la sécrétion pulsatile de LH après exposition à un stress psychosocial et est bien adapté pour l’évaluation des impulsions de LH en vertu d’autres manipulations aiguës ou chroniques.
Un élément …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les Drs Jennifer Yang et Alexandre (Sasha) Kauffman pour l’assistance technique avec cette technique, mais aussi les nombreuses discussions utiles et critiques. Dosages d’hormones sériques ont été réalisées par Yang et al., 2017 à The University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand test et analyse de base, pris en charge par le Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Sources de soutien à la recherche : R01 NICHD 86100 (KMB), Gar a été soutenue par 007203 NICHD T32.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
Riferimenti
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