Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano
Summary
Aquí presentamos un protocolo para producir Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) Esferoplastos y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplastos claramente visualizar y caracterizar rápidamente interacciones de péptido-bacterias. Esto proporciona un método sistemático para definir la localización de la membrana translocación de péptidos.
Abstract
Comúnmente, el uso de microscopia confocal como un método para determinar patrones de localización de péptidos dentro de las bacterias es inhibido por los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales. Como la resolución de un microscopio dado no puede ser fácilmente mejorada, presentamos protocolos para transformar la pequeña barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) en formas esféricas más grandes, fácilmente reflejadas llaman esferoplastos o protoplastos. Esta transformación permite observadores a rápidamente y claramente determinar si péptidos se alojan en la membrana bacteriana (es decir, localización de membrana) o cruzan la membrana para entrar en la célula (es decir, translocación). Con este enfoque, también presentamos un método sistemático para caracterizar péptidos como membrana de localización o translocación. Si bien este método puede utilizarse para una variedad de péptidos activos de membrana y cepas bacterianas, demostramos la utilidad de este protocolo mediante la observación de la interacción de Buforin II P11A (BF2 P11A), un péptido antimicrobiano (AMP), con e. coli Esferoplastos y protoplastos B. megaterium .
Introduction
Péptidos antimicrobianos (AMPs) han obtenido la atención debido a su uso potencial como alternativas a los antibióticos convencionales1,2,3,4,5. Amperios de matan bacterias por translocación a través de la membrana celular e interactuando con componentes intracelulares tales como ácidos nucleicos o por permeabilizing la membrana causando fugas de contenido de la célula6. Además de su uso como antibióticos, translocación amperios puede ser adaptado para solicitudes de entrega de medicamentos porque no disruptiva puede cruzar la membrana celular impermeable7,8. Por lo tanto, buscamos comprender los mecanismos fundamentales de la AMP de acción para sentar las bases para su uso en el diseño de fármacos.
La microscopia confocal ofrece una manera para determinar patrones de localización de fluorescencia etiquetadas amperios en células bacterianas proporcionando penetraciones en su mecanismo de acción9,10,11,12, 13 , 14. al etiquetado de la membrana de las bacterias, uno puede determinar si un péptido fluorescente etiquetado localiza a la membrana o en el espacio intracelular de una célula bacteriana. Sin embargo, esta técnica está limitada por el pequeño tamaño y barra de forma de bacterias, que puede hacer difícil debido a los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales y la orientación variable de las bacterias en la diapositiva15la proyección de imagen.
El objetivo del método presentado es mejorar la visualización de los patrones de localización de péptido fluorescente etiquetado usando microscopia confocal. Visualización se ha mejorado el pequeños, finos, barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) bacterias en formas de agrandamiento, esféricas conocido como Esferoplastos (para las cepas Gram negativas) y protoplastos (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. Esferoplastos y protoplastos son más fáciles de imagen debido a su mayor tamaño y su forma simétrica, lo que hace irrelevante para la proyección de imagen de la orientación de una bacteria sobre un portaobjetos. Además, presentamos un enfoque sistemático para analizar cuantitativamente datos de microscopia confocal para caracterizar amperios como cualquier membrana de localización o translocación. Aplicación de estos métodos resulta más fácil distinguir marcada fluorescencia patrones de localización de péptido. Los protocolos aquí presentados pueden utilizarse para evaluar la localización de una variedad de agentes activos de membrana distintos amplificadores, incluyendo péptidos de penetración celular.
Una clara ventaja de esta técnica es que proporciona penetraciones en el mecanismo de acción de amp a nivel unicelular, que puede revelar la heterogeneidad celular de la célula15, frente a otros ensayos de fluorescencia se utiliza comúnmente para identificar la mecanismos de acción de amperios, que sólo proporcionan a granel estimaciones9,22,23,24,25. El uso de Esferoplastos y protoplastos para evaluar la entrada de amplificador celular es útil particular26 porque son más fisiológico relevantes15 que otros modelos utilizados para evaluar la entrada de la célula, como lípido vesículas24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos aquí presentados hacen posible para los investigadores a obtener más rápidamente más grandes tamaños de muestra de imágenes bacterianas porque las bacterias ampliadas, esféricas son mucho más fáciles de ubicar, orientar y la imagen. Esta mayor capacidad para recopilar datos es valiosa en varios aspectos. En primer lugar, permite un análisis cuantitativo más sistemático de los patrones de localización de péptido. Mientras las tendencias cualitativas pueden demostrarse de pequeñas series de im…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIH-NIAID) Premio R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
Riferimenti
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochimica. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
