Produktion og visualisering af bakterielle Spheroplasts og Protoplasts til at karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at producere gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts at visualisere, klart og hurtigt karakterisere peptid-bakterier interaktioner. Dette giver en systematisk metode til at definere membran lokalisering og translocating peptider.
Abstract
Konfokal mikroskopi anvendes som en metode til at vurdere peptid lokalisering mønstre inden for bakterier er almindeligvis hæmmet af opløsning grænserne for konventionelle lys mikroskoper. Som opløsning for en given mikroskop ikke kan være let forbedret, præsenterer vi protokoller for at omdanne små stavformet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) i større, let afbildet sfæriske formularer kaldes spheroplasts eller protoplasts. Denne transformation tillader observatører til hurtigt og klart fastslå, om peptider indgive sig ind i den bakterielle membran (dvs, membranen lokalisering) eller krydse membran for at komme ind i cellen (dvs. translocating). Med denne tilgang fremlægge vi også en systematisk metode til at karakterisere peptider som membran lokalisering eller translocating. Mens denne metode kan bruges til en bred vifte af membran-aktive peptider og bakteriestammer, vi påvise nytten af denne protokol ved at observere samspillet mellem Buforin II P11A (BF2 P11A), et antimikrobielt peptid (AMP), med E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts.
Introduction
Antimikrobielle peptider (AMP’er) har fået opmærksomhed på grund af deres potentielle anvendelse som alternativer til konventionel antibiotika1,2,3,4,5. Ampere dræbe bakterier ved enten translocating over cellemembranen og interagere med intracellulære komponenter såsom nukleinsyrer eller af permeabilizing membranen forårsager lækage af celle indhold6. Ud over deres anvendelse som antibiotika, kan translocating ampere tilpasses for drug delivery ansøgninger fordi de kan ikke-båndstationer krydser uigennemtrængelige cellemembranen7,8. Derfor søger vi, at forstå grundlæggende AMP virkningsmekanismer at lægge fundamentet for deres anvendelse i stof design.
Konfokal mikroskopi tilbyder en måde at vurdere lokalisering mønstre af fluorescently mærket ampere i bakterieceller giver indsigt i deres mekanisme af aktion9,10,11,12, 13 , 14. ved mærkning membranen af bakterier, kan man bestemme, hvis en fluorescently mærket peptid lokaliserer membranen eller det intracellulære rum for en bakteriel celle. Dog, denne teknik er begrænset af den lille størrelse og stang form af bakterier, som kan gøre imaging udfordrende på grund af resolution grænserne for konventionelle lys mikroskoper og den variable orientering af bakterier på slide15.
Målet med metoden præsenteres er at aktivere udvidet visualisering af fluorescently mærket peptid lokalisering mønstre ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Visualisering er forbedret ved at dreje på små, tynde, stavformet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) bakterier i udvidet, sfæriske formularer omtales som spheroplasts (for gram-negative stammer) og protoplasts (for gram-positive stammer)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts og protoplasts er nemmere at billedet på grund af deres større størrelse og deres symmetriske form, hvilket gør orientering af en bakterie på et dias irrelevant for dens billeddannelse. Derudover præsenterer vi en systematisk metode til at analysere kvantitativt konfokalmikroskopi data for at karakterisere ampere som enten membran lokalisering eller translocating. Disse metoder gør det lettere at skelne fluorescently mærket peptid lokalisering mønstre. Protokollerne præsenteres her kan bruges til at vurdere lokalisering af en bred vifte af membran-aktive agenter end ampere, herunder celle-gennemtrængende peptider.
En klar fordel af denne teknik er, at det giver et indblik i virkningsmekanismen af ampere på en enkelt celle niveau, som kan afsløre celle til celle heterogenitet15, i modsætning til andre fluorescens assays almindeligt anvendt til at identificere de virkningsmekanismer ampere, som kun giver bulk skøn9,22,23,24,25. Brug af spheroplasts og protoplasts for at vurdere AMP celleindtastning er særlig nyttige26 , fordi de er mere fysiologisk relevante15 end andre modeller, der anvendes til at vurdere celleindtastning som lipid vesikler24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollerne præsenteres her gøre det muligt for forskere at hurtigere få større stikprøvestørrelser af bakteriel billeder fordi de udvidede, kugleformede bakterier er meget lettere at finde, orientere og image. Denne udvidede evne til at indsamle data er værdifulde i flere henseender. Først, det giver mulighed for en mere systematisk kvantitativ analyse af peptid lokalisering mønstre. Mens kvalitative tendenser kan godtgøres fra mindre sæt af billeder, kun stor stikprøve sæt af billeder i høj kvalitet afs…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning blev støttet af National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (NIH-NIAID) award R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
Riferimenti
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochimica. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
