ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצר גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) spheroplasts, גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) protoplasts כדי להמחיש באופן ברור ולאפיין במהירות אינטראקציות פפטיד-חיידקים. זה מספק שיטה שיטתית כדי להגדיר ממברנה ההתאמה לשפות אחרות, translocating פפטידים.
Abstract
השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית כשיטה להעריך פפטיד תבניות לוקליזציה בתוך חיידקים בדרך כלל מעוכב לגבולות ברזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי. כמו הרזולוציה עבור מיקרוסקופ נתון לא יכול להיות משופרת בקלות, אנו מציגים פרוטוקולים להפוך את קטן בצורת מוט גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) ואת גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) בטפסי כדורית, בקלות תמונה גדולים נקרא spheroplasts או protoplasts. שינוי זה מאפשר משקיפים במהירות ובבהירות לקבוע אם פפטידים lodge עצמם לתוך קרום חיידקי (קרי, ממברנה לוקליזציה) או לעבור את הממברנה כדי להזין את התא (קרי: translocating). מתוך תפיסה זו, אנו מציגים גם שיטה שיטתית כדי לאפיין פפטידים כמו קרום לוקליזציה או translocating. ואילו בשיטה זו יכול לשמש למגוון רחב של פפטידים ממברנה-פעיל, זני חיידקים, נדגים את התועלת של פרוטוקול זה על ידי התבוננות האינטראקציה של Buforin השני P11A (BF2 P11A), פפטיד מיקרוביאלית (אמפר), עם e. coli spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts.
Introduction
פפטידים מיקרוביאלית (אמפר) השיגו תשומת לב בשל שימושם פוטנציאליים כחלופות אנטיביוטיקה קונבנציונלית1,2,3,4,5. מגברים להרוג חיידקים על ידי translocating על פני קרום התא או אינטראקציה עם רכיבים תאיים כגון חומצות גרעין, או על-ידי permeabilizing קרום גורמת זליגת של תוכן התא6. בנוסף, השימוש בהם כמו אנטיביוטיקה translocating אמפר שעשוי להיות מותאם עבור יישומים משלוח סמים כי הם יכולים לעבור ללא disruptively7,את קרום התא אטום8. אנו, לכן מבקשים להבין את המגבר הבסיסי, מנגנוני פעולה כדי להניח את הבסיס לשימוש שלהם בעיצוב סמים.
מיקרוסקופיה קונפוקלית מציע דרך להערכת לוקליזציה דפוסי אמפר fluorescently שכותרתו תאים חיידקיים לספק תובנות שלהם מנגנון פעולה9,10,11,12, 13 , 14. על-ידי תיוג הקרום של החיידקים, ניתן לקבוע אם פפטיד fluorescently שכותרתו רגישה הקרום או המרחב תאיים של תא החיידק. עם זאת, טכניקה זו הוא מוגבל על ידי הצורה הגודל של רוד קטנה של חיידקים, אשר יכול לגרום הדמיה מאתגר עקב לגבולות ברזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ואת הכיוון משתנה של החיידקים על שקופית15.
מטרת השיטה הציג היא לאפשר הדמיה משופר של הדפוסים לוקליזציה פפטיד fluorescently שכותרתו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ויזואליזציה היא משופרת על-ידי הפעלת את קטן, דק וקל מוט בצורת גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) ואת גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) חיידקים בטפסי מוגדלת, כדורית המכונה spheroplasts (עבור זנים גראם שליליים), protoplasts (עבור זנים גראם חיוביים)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts ו- protoplasts הם קל יותר התמונה בשל גודלם מוגבר והן צורתם סימטרי, מה שהופך את הכיוון של חיידק בשקופית לא רלוונטי עבור הדמיה שלה. בנוסף, אנו מציגים בגישה שיטתית לנתח באופן כמותי מיקרוסקופיה קונפוקלית נתונים על מנת לאפיין אמפר כמו גם קרום לוקליזציה או translocating. יישום שיטות אלה מקל להבחין fluorescently שכותרתו פפטיד לוקליזציה דפוסים. הפרוטוקולים המובאות כאן ניתן להעריך הלוקליזציה של מגוון של ממברנה-פעיל סוכני חוץ אמפר, לרבות פפטידים חודר לתא.
אחד יתרון משמעותי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תובנות מנגנון הפעולה של מגברים ברמה תא בודד, אשר עלול לגלות-לתא הטרוגניות15, לעומת שאר מבחני פלורסצנטיות נפוץ כדי לזהות מנגנוני הפעולה של מגברים, אשר מספקים רק בצובר הערכות9,22,23,24,25. השימוש spheroplasts ו- protoplasts על מנת להעריך את ערך התא המגבר הוא שימושי במיוחד26 כי הם רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית15 מאשר דגמים אחרים בשימוש להערכת ערך התא, כגון שלפוחית השומנים24.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים המובאת כאן לעשות את זה אפשרי לחוקרים במהירות רבה יותר לקבל גודל מדגם גדול יותר של תמונות חיידקי כי החיידק מוגדלת, כדורית הם הרבה יותר קל לאתר, אוריינט של התמונה. היכולת המשופרת לאיסוף נתונים יקר במספר אופנים. ראשית, הוא מאפשר ניתוח כמותי שיטתית יותר דפוסי לוקליזציה פפטיד. בעוד ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ופרס מחלות זיהומיות (NIH-NIAID) R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
Riferimenti
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochimica. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
