Summary

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

Published: July 30, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Abstract

Transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering reguleert vele belangrijke functies die nodig zijn voor cellulaire homeostase en wordt vaak gevonden in veel ziekten, waaronder kanker overexpressie. TGF-β is sterk betrokken bij de metastase tijdens late stadium kanker progressie, het activeren van een subset van migratiestromen en invasieve tumorcellen. Huidige methoden voor signalering traject analyse richten op eindpunt modellen, die vaak proberen te meten van signalering post-hoc van de biologische evenement en komen niet overeen met de progressieve aard van de ziekte. Hier tonen we een nieuwe adenovirus verslaggever systeem specifiek voor de TGF-β/Smad3 signalering traject dat transcriptionele activering in levende cellen kan detecteren. Gebruik makend van een verslaggever van Ad-CAGA12-Td-Tom , kunnen we een 100% besmettingsgraad van MDA-MB-231 cellen binnen 24u in vitro. Het gebruik van een fluorescerende verslaggever zorgt voor de beeldvorming van levende enkele cellen in real time met rechtstreekse identificatie van transcriptionally actieve cellen. Stimulatie van geïnfecteerde cellen met TGF-β wordt alleen een subset van cellen die transcriptionally actief en betrokken in de specifieke biologische functies zijn weergegeven. Deze aanpak zorgt voor hoge specificiteit en de gevoeligheid op het niveau van een eencellige om inzicht in de biologische functies gerelateerde TGF-β signalering in vitro. Smad3, transcriptionele activiteit kan ook worden gerapporteerd in vivo in real-time door de toepassing van een Ad-CAGA12– Luc verslaggever. Ad-CAGA12– Luc kan worden gemeten op dezelfde wijze als traditionele stabiel transfected luciferase cellijnen. Smad3 transcriptionele activiteit van cellen geïmplanteerd in vivo kan worden geanalyseerd door middel van conventionele IVIS imaging en gecontroleerd live tijdens de progressie van de tumor, unieke inzicht bijbrengen in de dynamiek van de signalering TGF-β-pathway. Ons protocol beschrijft een voordelige verslaggever leveringssysteem toestaan voor snelle high-throughput beeldvorming van levende cellen signaling pathways zowel in vitro als in vivo. Deze methode kan worden uitgebreid tot een scala aan beeld gebaseerde testen en presenteert als een gevoelige en reproduceerbare aanpak voor zowel de fundamentele biologie en de therapeutische ontwikkeling.

Introduction

Transformeren groeifactor β (TGF-β) is een essentiële cytokine betrokken in de menselijke ontwikkeling die signalen via een heterodimeric complex bestaande uit type II en type ik receptoren1. Binding met de type II receptor resultaten bij de werving en fosforylering van type ik receptor, dat op zijn beurt kinaseenzym stroomafwaarts Smad2/3 eiwitten2,3. Deze Smad2/3 eiwitten binden aan Smad4, vormen een complex dat translocates in de kern en regelt gene transcriptie4geactiveerd. Homeostatische voorwaarden TGF-β/Smad is signalering strak geregeld is; echter in vele ziekten, het signalering traject is gedereguleerd en vaak leiden tot progressie van de ziekte5,6,7overexpressie. Recente studies hebben aangetoond dat cellulaire reactie op TGF-β heterogeen is en subpopulaties van TGF-β/Smad actieve cellen verantwoordelijk voor biologische functie in een tijd-afhankelijke manier8,9 zijn. Gemeenschappelijke cellulaire analyse van TGF-β/Smad signalering impliceert het gebruik van vaste eindpunt tests die bieden slechts een momentopname van cellulaire activiteit en de gemiddelde TGF-β/Smad effect10vaak te kwantificeren. Deze methoden, maar kunnen niet nauwkeurig vertegenwoordigen de moleculaire gedrag van TGF-β/Smad signalering in de fysiologische staat tijdens de progressie van de ziekte. Beeld-gebaseerde analyse van levende cellen vangen de dynamiek van cellulaire en biologische processen met beide een ruimtelijke en temporele begrip.

Ons doel was het ontwikkelen van een gevoelige methode hoge gegevensdoorvoer voor levende cellen beeldvorming van TGF-β/Smad signalering gebruikmaken van adenovirus gebaseerde reagentia. Hier, besmet we de menselijke borst kanker cellijn MDA-MB-231 met een uiting van de Smad3 CAGA motief bindende volgorde en een luciferase (Luc) of Td-tomaat (Td-Tom) verslaggever gene adenovirus. Adenovirale verslaggever systemen bieden een snelle en goedkope methode voor het plasmide inleiding is die in een 100% besmettingstarief in kanker cellijnen resulteren kan. Adenovirale verslaggever systemen hebben ook met succes toegepast op cellijnen die moeilijk te transfect met conventionele plasmide11. In dit protocol beschrijven we een reproduceerbare en noninvasive proces om levende cellen beeldvorming van de signalering traject van TGFβ/Smad zowel in vivo en in vitro.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Universiteit van Melbourne dier ethisch comité. Opmerking: De volgorde, de bouw en de generatie protocol voor de adenovirale vectoren pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP en pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom geweest eerder beschreven11,,12, 13. Alle vectoren zijn commercieel verkrijgbaar. 1. virus Titer bepaling me…

Representative Results

Levende eencellige beeldvorming in vitro Om te nauwkeurig beoordelen de activering van TGF-β/Smad signalering in afzonderlijke cellen met behulp van adenovirus gebaseerd reagentia, is het belangrijk om eerst de optimale multipliciteit van infectie (MOI) voor elke regel van de cel. De optimale MOI wordt bepaald wanneer 100% van de cellen positief voor adenovirale infectie met geen huidige cytopathogeen of cytotoxische effe…

Discussion

Hebben we een techniek om te voorzien in real-time beeldvorming van TGF-β/Smad3 signalering in één levende cellen. Met deze nieuwe methode hebben we eerder een subpopulatie van cellen geïdentificeerd met dynamische TGF-β/Smad3 transcriptionele activiteit die werd geassocieerd met verbeterde invasie en migratie8. Deze methode verbetert op traditionele testen voor TGF-β signalering, zoals westelijke vlekken van Smad3 fosforylatie en TGF-β gerichte genexpressie, door het vastleggen van de hete…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) aan H-JZ. TMBW is een ontvanger van een Australia postdoctorale Award van de Australische overheid en de Ann Henderson oplaadbeurt beurs van Australische Rotary gezondheid in partner met Rotary van hoorn en Dine voor een kuur.

Materials

DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

Riferimenti

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
check_url/it/57926?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Chen, H., Ware, T. M., Iaria, J., Zhu, H. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

View Video