Summary
여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.
Abstract
형광 현미경 검사 법 단일 분자 수준에서 복잡 한 생물 학적 과정의 메커니즘을 해 부에 큰 기여를 했다. 단일 분자 DNA 단백질 상호 작용을 공부에 대 한 분석에서 고려에 대 한 두 가지 중요 한 요소는: 쉽게 관찰 하 고 적합 한 형광 프로브는 단백질을 라벨에 대 한 충분 한 길이와 DNA 기질. 48.5 kb λ DNA DNA 기판에 대 한 좋은 후보입니다. 양자 점 (Qdots), 형광 프로브 클래스로 장기간 관찰 (시간 분)와 높은 품질 이미지 수집 수 있습니다. 이 논문에서는, site-specifically 수정된 λ DNA를 준비 하 고 라벨 streptavidin 입히는 Qdots와 대상 단백질을 포함 하는 단일 분자 수준에서 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜 선물이. 개념 증명에 대 한 우리 오크 (복잡 한 원산지 인정) 신진 효 모에 관심사의 단백질으로 선택한 TIRFM 사용 하는 ARS (자동으로 복제 시퀀스)와 상호 작용을 시각화 합니다. 다른 형광 프로브에 비해, Qdots photobleaching에 대 한 그것의 높은 안정성 때문에 단일 분자 연구에 분명 한 이점이 있다 하지만이 속성 양적 분석에 응용 프로그램 제한에 주목 한다.
Introduction
단백질 및 DNA 사이 상호 작용, DNA 복제, DNA 수리, 전사 등 많은 복잡 한 생물 학적 과정에 필수적입니다. 기존의 접근 이러한 프로세스의 속성에 빛을 발산가, 비록 많은 키 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 최근, 급속 하 게 발전 한 분자 기술로 메커니즘의 일부 해결된1,2,3되었습니다.
주로 단백질 DNA 상호 작용을 실시간으로 시각화에 단일 분자 형광 현미경 검사 법의 응용 프로그램의 형광 탐지 및 형광 프로브 개발에 따라 달라 집니다. 단일 분자 연구를 위해 그것은 형광 탐지 시스템은 주로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 적합 한 형광 프로브 관심사의 단백질을 분류 하는 것이 중요.
형광 단백질 분자 생물학에 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 낮은 형광 밝기 및 photobleaching에 대 한 안정성 많은 단일 분자 분석에 응용 프로그램을 제한합니다. 양자 점 (Qdots)는 작은 발광 나노 입자4. 그들의 독특한 광 속성으로 인해 Qdots은 10-20 배 더 밝다 고 몇 천 배 더 많은 안정 보다 널리 사용 되는 유기 염료5. 또한, Qdots 있다 큰 Stokes shift (여기 및 방출 봉우리의 위치 사이의 차이)5. 따라서, Qdots 동안 양적 분석에서 이용 될 수 없습니다 오랜 관찰 (시간 분) 및 높은 신호 대 잡음 비율, 이미지의 수집에 대 한 사용할 수 있습니다.
날짜 하려면, site-specifically Qdots와 대상 단백질을 분류 하는 방법은 두 가지: Qdot 활용 된 주 또는 보조 항 체6,,78;의 원조로 또는 대상 단백질 Qdots와 직접, biotin와 streptavidin9,10,11,,1213사이 강한 상호 작용을 기반으로 라벨. Qdots Streptavidin 입히는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 연구에서 site-specifically biotinylated 단백질을 높은 효율으로 신진 효 모에 BirA Avi 태그 단백질의 공동 overexpression에 의해 정화 되었다 vivo에서10. 다음 하 고 단일 분자 분석 실험14,15,,1617최적화, 단일 분자 수준의 사용에 Qdot 표시 된 단백질 및 DNA 사이 상호 작용 관찰 TIRFM10.
여기, 우리가 선택한 신진 관심사의 우리의 단백질으로 원래 인식 복잡 한 (오크)을 구체적으로 인식 하 고 자율적으로 복제 시퀀스 (ARS)에 바인딩할 수, 효 모. 다음 프로토콜 TIRFM를 사용 하 여 Qdot 표시 된 오크 ARS와의 상호 작용을 시각화 하는 단계별 절차를 제공 합니다. Site-specifically 수정된 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름 셀 어셈블리 및 단일 분자 이미징의 준비는 설명 합니다.
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Protocol
1. λ-ARS317 DNA 기판의 준비
- DNA 기판 건설 및 포장
- 소화 Xho을 사용 하 여 네이티브 λ DNA 나 효소; ARS317 신진의 genomic DNA에서 20를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 효 모 543 bp DNA 조각 베어링 증폭 bp 동종 시퀀스의 업스트림 및 다운스트림 Xho나 람다 DNA에서 효소 사이트. 추가 100 ng Xho의 λ DNA와 10 소화 DNA의 ng 동종 재결합 반응 시스템, 10 µ L를 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 반응을 품 어.
- 재결합 λ DNA 패키지, 재결합 제품으로 람다 포장 추출의 25 µ L을 추가 하 고 90 분 30 ° C에서 반응을 품 어. 그런 다음 람다 포장 추출 반응 관에의 한 추가 25 µ L를 추가 합니다. 계속 품 어 90 분 30 ° C에서 반응.
- 반응 시스템에 살 균 희석 버퍼 (10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 m m MgCl2)의 500 µ L을 추가 하 고 부드럽게 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합. 클로 프롬의 25 µ L을 추가 하 고, 부드럽게 혼합, 4 ° c.에 저장
- 포장 된 살 균 소의 100 µ L 및 100 µ L 세균 LE392MP의 추가 (0.8-에서 교양 1.0 파운드 매체 10 mm MgSO4추가 사용 하 여) 새로운 튜브로. 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 4 mL oftop agar (파운드 매체 + 0.7% agar 10mm MgSO4, 48 ° C에 냉각)으로 살 균 소 박테리아 혼합물의 200 µ L를 추가 합니다. 즉시 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 파운드 접시에 부 어.
- 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 그리고 λ-ARS317 패 PCR를 사용 하 고 시퀀싱 화면.
- 액체 lysates11,18 에서 DNA 기질 정화
- 살 균 ddH2O 10 m MgCl2 와 10 nM CaCl2의 200 µ L로 한 패를 선택 합니다. 200 µ L의 박테리아 LE392MP (파운드 매체에서 교양된 하룻밤)와 함께 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- NZCYM의 100 mL에 박테리아 살 균 소 혼합물을 추가 (10 g/L 뉴질랜드-아민, 5 g/L 효 모 추출 물, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino의, 그리고 2 g/L MgSO4·7H2O) 37 ° c.에 7 h에 대 한 문화와 매체 문화에 클로 프롬의 250 µ L을 추가 하 고 다른 10 분 동안 흔들어.
- 200 mL 플라스 크에 문화를 전송 합니다. NaCl (1 M 최종 농도)의 5.8 g를 추가 하 고, 해산 저 어 30 분 동안 얼음에 품 어.
- 셀 파편 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 200 mL 플라스 크에는 상쾌한을 수집 하 고 10% 말뚝8000 (m/V) 추가. 자석 교 반 장치에 의해 해산 하 고 30 분 이상 얼음에 품 어 저 어.
- 살 균 소 침전에 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.
- 살 균 소 희석 버퍼의 2 mL에 침전을 resuspend. 15 mL 튜브로 전송 하 고 RNase (최종 농도 20 µ g/mL)의 10 µ L 및 DNase (최종 농도 5 µ g/mL)의 40 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 0.3의 2 개 mL를 추가 M Tris HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1.25 %SDS, 15 µ L 성분 K (최종 농도 10 µ g/mL). 10 분 동안 65 ° C에서 품 어.
- 사전 냉각된 칼륨 아세테이트 (3 M, pH 4.8)의 2 개 mL를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.
- 불용 성 물질을 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 8000 x g에서 원심.
- 에 상쾌한 소 프로 파 놀의 0.7 x 볼륨을 추가 합니다. 거꾸로 여러 번 튜브를 설정 하 여 혼합 하 고 실내 온도 (RT)에 2 분 동안 품 어.
- DNA를 침전 하는 RT에 10 분 동안 8000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.
- 일단 70% 에탄올 10 분에 대 한 8000 x g에서 원심 분리 하 여 제거는 상쾌한 DNA를 씻어.
- 부드럽게, 500 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 m m EDTA, pH 8.0)를 사용 하 여 DNA elute 그리고 1.5 mL 튜브에 DNA를 전송.
- 두 번 페 놀을 사용 하 여 DNA를 추출: 10 분에 대 한 8000 g에서 원심 분리 하 여 클로 프롬.
- 0.7 x 볼륨 소 프로 파 놀과 침전. 거꾸로 튜브, 부드럽게 내려와 10 분 동안 8000 x g에서 원심 회전 하 여 혼합.
- 한 번 70% 에탄올으로 씻어, 테의 200 µ L에서 resuspend. DNA 농도 측정 하 고 12.5 µ g aliquots에-20 ° C에서 저장.
2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
- Biotinylated oligonucleotides phosphorylate를 (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-비오 틴-3') 출신의 왼쪽된 끝에 보완 λ DNA, oligonucleotides ddH2O, 1 µ L의 리가 버퍼, x 10의 7.5 µ L, T4 PNK의 0.5 µ L의 1 µ L (100 µ M)를 추가. 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.
- Λ-ARS317 phosphorylate, λ-ARS317의 12.5 µ g, 3 µ L 리가 버퍼 x 10의 추가, T4 PNK ddH2O 30 µ L의 총 볼륨의 1 µ L 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.
- Λ-ARS317와 oligonucleotides anneal, phosphorylated oligonucleotides의 0.5 µ L, ddH2O, phosphorylated λ-ARS317 관에 10 × 리가 버퍼의 25 µ L의 195 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 65 ° C 블록 히터, 고 하자 블록에 33 ° C 아래에 샘플 쿨 5 분 턴에서 품 어.
- Λ-ARS317와 oligonucleotides 선, T4 DNA 리가의 1 µ L와 ATP (200 m m)의 0.63 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 하룻밤 실 온에 2 시간 또는 4 ° C에서 품 어. 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다.
참고: 헤어 지는 DNA를 방지 하려면 모든 혼합 단계 할 수 하 여 부드럽게 튜브 거꾸로, 펫을 사용 하 여 혼합 하는 대신.
3. Coverslip 청소 및 기능화
- 청소 하는 Coverslip
- 4 착 색 항아리 (5 coverslips/병)에 장소 20 coverslips 에탄올, 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴.
- 1 M 수산화 칼륨 (KOH), 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴. 에탄올 및 코 쥡니다 한 번 반복 합니다.
- 30 분 동안, 아세톤과 sonicate 고 다음 초순 H2O 철저 하 게 린스 (3 번 이상).
참고: 아세톤 제거 해야 합니다 철저 하 게 rinsing 초순 H2O, 여 때 실수로 고생 솔루션 (아세톤) 등 유기 용 매 혼합 폭발이 발생할 수 있기 때문에14. - 피 라 솔루션에는 coverslips를 배치 (H2의 3:1 혼합 등4 과 30% H2O2)와 1 시간 동안 95 ° C에 품 어.
참고: 피 솔루션은 높은 활력과 침식, 그래서 신중 하 게 사용. 준비할 때 피 솔루션, 500 mL 유리 비 커에 H2O2 의 50 mL를 먼저 추가 하 고 그래서 H2의 150 mL를 추가 합니다4 비 커에 천천히. - 5 번 초순 H2O coverslips를 헹 구 십시오. 다음 각 coverslip 초순 H2O 3 비 커 가득 초순 H2O를 사용 하 여 철저 하 게 세척 하 고 건조 coverslip는 coverslip의 가장자리에서 종이 사용 하 여. 얼룩 항아리에는 coverslip를 놓고 30 분 동안 coverslip 110 ° C 오븐에서 철저 하 게 건조 합니다.
- 메탄올을 가진 coverslip 린스 고 얼룩 단지 110 ° C 오븐을 다시는 coverslip 철저 하 게 건조 합니다.
참고:는 coverslip 철저 하 게 건조 매우 중요 하다, 물19존재는 일단 항 가능한 표면 구조를 많이 있을 것 이다 때문에.
- 메탄올을 가진 coverslip 린스 고 얼룩 단지 110 ° C 오븐을 다시는 coverslip 철저 하 게 건조 합니다.
- Coverslip 기능화
- 실 란 솔루션의 70 mL을 추가 (93% 메탄올, 아세트산, % 및 2 %5 항) 각 항아리에 뚜껑을 나사와 하룻밤 실 온에서 항아리를 두고.
- 워시와 3.1.5, 건조 오븐에서 그들을 배치 하는 대신 철저 하 게 질소 가스를 사용 하 여 coverslips를 제외 하 고 단계에 설명 된 대로 coverslips를 건조.
- 0.1 m M 신선한 만든 NaHCO3 (pH 8.2) 1 mL에 150mg mPEG (methoxy-폴 리 에틸렌 글리콜)의 biotin-말뚝 (biotin-폴 리 에틸렌 글리콜)의 6 mg를 철저 하 게 분해. 17 다음 원심 분리기, 불용 성 못을 제거 하는 1 분 동안 000 x g.
참고: 갓 만든된 NaHCO3 은 준비; pH를 조정할 필요가 있다. - 상자에 silanized coverslips를 놓고 두 개의 작은 coverslips silanized coverslips의 두 끝 위에 넣어. 100 µ L silanized coverslip의 중앙에 못 솔루션의 플라스틱 그리고 다른 silanized coverslip 상단에 배치.
- 습기가 유지 상자에 일부 초순 h 조2O를 추가 하 고 어둠 속에서 적어도 3 h 말뚝 솔루션 coverslips를 품 어. 야간 보육도 사용할 수 있습니다.
- Coverslip 쌍을 분리 하 고 기능성된 표면 얼굴 유지, 린스 초순 h 조2O를 사용 하 여 광범위 하 게, coverslips 질소 가스와 함께 그들을 건조.
- 표시 마커 펜, 기능성된 측면 얼굴, 상자에 넣어에 저장 하는 상자 진공 desiccator 1 개월 유지를 사용 하 여 모서리 중 하나에 coverslips의 기능성된 측면.
- 긴 시간 동안에 coverslips를 저장 하 한 coverslip 모자에 1 개의 구멍을 뚫고 50 mL 튜브에 다음 비닐 봉지에 튜브를 넣어 놓고 진공 실러를 사용 하 여 가방을 봉인 합니다. 이 방법에서는, coverslips는 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 약 3 개월.
4. 흐름 셀 조립
- 양면 테이프 (30 m m × 12 m m)는 주먹을 사용 하 여 조각의 센터에서 15 m m × 2 m m 채널을 절단.
- 양면 테이프의 종이 쪽을 벗기십시오 고 두 개의 구멍을 유리 슬라이드에 붙여 넣습니다. 기포 제거를 누릅니다. 우리의 경험을 바탕으로, 그것은 쉽게 양면 테이프의 플라스틱 측면 보다 종이 쪽을 벗 하 여 기포를 제거 하.
- 4 기능성된 coverslip (60 m m × 24 m m)를 잘라 조각 (30 × 12 mm) 다이아몬드로 만들어진 유리를 사용 하 여 학자, 하 고 질소 가스를 사용 하 여 파편을 제거. 기능성 유지 해야 측면 얼굴.
- 이중 면 테이프의 플라스틱 면을 벗기십시오 고 기능성된 coverslip에 슬라이드를 붙여 넣습니다. 기포는 coverslip와 테이프를 제거 하려면을 살짝 누릅니다. 철저 하 게 공기 방울을 제거 버퍼 했다 그것으로 펌핑 하는 동안 누출에서 흐름 세포를 보호할 수 있습니다.
- 입구와 출구 배관에 삽입 작은, 큰 구멍, 각각. 에폭시를 사용 하 여 튜브를 수정 합니다.
- Streptavidin (0.2 mg/mL)의 20 µ L 주사기를 사용 하 여 수동으로 흐름 세포로 펌프 하 고 10 분 동안 RT에서 품 어. 블로킹 버퍼10 streptavidin, 대체 흐름 세포로 펌프 그리고 실내 온도에서 보관.
5. 단일 분자 시각화
- 532 nm 레이저와 640 nm 레이저를 사용 하 여 동시 여기 빨간색과 형광 현미경 테스트 슬라이드 # 1에서 a 5와 빨강의 초점 맞춤 얻을. 듀얼 파장 광학 (참조 테이블의 재료)를 분할 이미지를 생산.
- 흐름 세포를 현미경에 놓고 10 mL 스프링 자동된 주입/철수 프로그래밍 가능 펌프에 설치 된 더 이상 배관 연결 콘센트 배관 연결.
참고: 주사기를 흐름 셀의 입구 배관에서 버퍼를 인출 하는 방법 아래에 언급 하는 흐름 셀으로 버퍼를 펌핑. - 공기를 신속 하 게 제거 하 여 흐름 셀에 버퍼 차단이 되었는지 확인 흐름 셀에 500 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프. 그리고 흐름 세포에 200 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프 콘센트 튜브 입구 배관 및 흐름 셀에서 기포를 완전히 제거를 플립.
참고: 모든 버퍼 흐름 셀으로 펌핑 해야 될 degassed 진공 desiccator에 사용 하기 전에 적어도 15 분 동안. - 블로킹 버퍼의 80 µ L로 biotinylated λ-ARS317 DNA의 0.5 µ L을 추가 하 고 2 분 25 µ L/min 흐름 셀에 펌프. 다음 50 µ L/분의 속도로 차단 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 λ-ARS317 DNA 플러시.
- 흐름 세포에 블로킹 버퍼를 제거 하 50 µ L/min의 속도로 버퍼10 바인딩 200 µ L 펌프.
- 0.2 µ L streptavidin 입히는 Qdot705 (1 µ M)의 추가 및 biotinylated 오크의 0.2 µ L (1.2 µ M) 튜브로 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 다음 버퍼 튜브에 바인딩 20 µ L을 추가 하 고 얼음에 놓습니다. 오크 Qdot705 의 최종 농도 약 10 nM.
- 2 µ L 오크 Qdot705 의 추가 (10 nM), DTT (100 m m), 바인딩 버퍼의 96 µ L로 ATP (200 m m)의 1 µ L의 1 µ L. 오크 Qdot705 의 최종 농도 0.2 nM.
- 흐름 셀에 10 µ L/min의 속도로 0.2 nM 오크 Qdot705 의 20 µ L를 펌프. 100 µ L/min의 속도로 바인딩 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 과도 한 오크 Qdot705 의 밖으로 플러시. 다음 100 µ L/min의 속도로 DNA 기판 얼룩 흐름 셀으로 30 nM SYTOX 오렌지 펌프 바인딩 버퍼.
- 오크 Qdot705 신호를 자극 하 고 SYTOX 오렌지 스테인드 DNA 신호 각각 405 nm 레이저와 532 nm 레이저를 사용 하 여. 쿼드-밴드 대역 통과 필터 (FF01-446/510/581/703-25)를 사용 하 여 100 µ L/min 흐름으로 신호를 동시에 관찰 하 고 프레임 당 100 ms와 EM CCD로 이미지를 기록 합니다. 다양 한 분야에서 20 이미지 스택을 수집 합니다.
6. 데이터 분석
- 캘리포니아 대학교 샌 프란 시스 코 박사 론 베일의 연구소에 의해 개발 된 이미지 플러그인 (OI_cut_RGBmerge)를 기반으로 하는 새로운 플러그인, 스스로 의해 수정 되는 피지 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 자르기.
- 이미지 (512 × 512 픽셀)의 스택 이미지 (256 × 256 픽셀)의 2 개 더미로 자르기. 하나는 532 nm 레이저 흥미로운 결과, 그리고 다른 한 405 nm 레이저 흥미로운 결과.
- 피지-이미지-스택-Z 프로젝트 (평균 강도)를 사용 하 여 61 순차적인 이미지를 처리 합니다.
- 측정 길이 (LDNA) DNA와 dna의 DNA에 오크 Qdot705 (L오크) 바인딩 사이트에서 거리의 끝을 수동으로 곁.
- L오크/LDNA 의 결과 계산을 사용 하 여 excel r, 부트스트랩 메서드를 사용 하 여 데이터를 분석 그리고 히스토그램을 생성, 가우스 배급에 맞게.
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Representative Results
Qdot 표시 된 오크는 ARS의 상호작용을 시각화 하려면 우리가 먼저 λ-ARS317 DNA 기판 건설. ARS317를 포함 하는 DNA 조각 통합 되었다 Xho에 내가 사이트 (33.5 kb) 네이티브 λ DNA의 동종 재결합 (그림 1A). 재결합 제품 추출 물을 사용 하 여 패키지 된 고 포장된 살 균 소 입자 파운드 플레이트 (그림 1B)에 경작 되었다. 긍정적인 살 균 소 패 PCR에 의해 상영 되었고 (그림 1C)을 시퀀싱에 의해 확인. Λ-ARS317 DNA는 액체 lysates (그림 1D)에서 순화 되었다.
단일 분자 이미징 분석 실험 목적 형 TIRFM 설정 (그림 2)에 실행 되었다. 거의 1:1 어 금 니 비율 biotinylated 오크의 라벨 streptavidin 입히는 Qdots, Qdot 표시 된 오크 λ-ARS317 테더 흐름 셀에 펌핑 되었다. DNA는 SYTOX 오렌지를 사용 하 여 얼룩 했다. Qdot 표시 된 오크 및 SYTOX 오렌지 스테인드 DNA의 신호 TIRFM (그림 3A-3 C)를 사용 하 여 동시에 몇 군데 있었다. Λ-ARS317에 오크의 배포를 확인 하려면 이미징 스택 두 더미로 분리 되었다: DNA 신호 및 오크 신호 단계 6.1 (그림 3B)에서 설명한 대로 다른 스택 하나의 스택. 수식, 위치 (kb)에 따라 = (L오크/LDNA) × 50 kb (그림 3D), 273 바인딩 168 DNA 기판에 오크 Qdot705 분자의 위치 quantitively 분석 했다. 데이터 보여주었다 오크 Qdot705 특별히 바인딩합니다 (그림 3E) 분명히 높은 풍부한 삽입 하는 ARS317 사이트에 . 한편, 오크 Qdot705 는 또한 중간과10이전 연구 결과와 일치 하는 λ DNA의 자유로운 끝에 위치한 AT 풍부한 지역에 바인딩합니다.
높은-품질의 이미지 수집 라벨 분석 결과에서 단백질 및 Qdots의 어 금 니 비율에 따라 달라 집니다. 과도 한 Qdots 단백질 효율, 라벨에 대 한 좋은 수 있습니다 하지만 그들은 배경 잡음을 만들 수 있습니다. Biotinylated 1:3 어 금 니 비율에서 streptavidin 입히는 Qdots와 오크 라벨 동안 그림 4와 같이 배경 소음 증가. 따라서, streptavidin 입히는 Qdots biotinylated 단백질의 적절 한 어 금 니 비율을 선택 하는 것이 중요 하다.
그림 1: λ-ARS317 DNA 기판의 준비. (A) λ-ARS317 건축의 그림. ARS317 베어링 DNA 파편은 동종 재결합 하 여 λ DNA에 통합 이었다. (B) 파운드 고체 매체에 플 라크. 3 명은 검은 화살표를 사용 하 여 표를 했다. (C) λ-ARS317 패 PCR를 사용 하 여 확인 되었습니다. (왼쪽) 표식, (중간) 네이티브 λ DNA (오른쪽) λ-ARS317의 패. (D) 정화 λ-ARS317 DNA는 0.6 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 발견 되었다. (왼쪽) 마커, (중간) 네이티브 λ (오른쪽) DNA λ-ARS317 정화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 목표 형 TIRF와 흐름 셀의 도식 개요. 단일 분자 이미징 분석 TIRFM 흐름 셀 시스템 결합에 따라 실시 했다. 우리의 TIRFM는 거꾸로 한 현미경 장착 오일 목표 X 60에서 수행 되었다 (수 가늠 구멍 = 1.49). DNA (회색 선) 곁에 biotin streptavidin 연계를 통해 흐름 셀에 coverslip에 그리고 오른쪽에서 왼쪽 흐름에 의해 형성 된. 속박 되 DNA에 단백질 바인딩 레드 타원형 점으로 표시 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Qdot705-오크 (1:1 어 금 니 비율) λ-ARS317에 바인딩 표시. (A) 오크 및 λ-ARS317 DNA는 동시에 관찰 되었다. (맨 위) SYTOX 오렌지 스테인드 DNA 532 nm 레이저를 사용 하 여 및 쿼드-밴드 대역 통과 필터의 550-613 nm 전송 밴드를 사용 하 여 관찰 흥분 했다. (아래) Qdot705-레이블이 오크 405 nm 레이저를 사용 하 여 흥분 되었고, 663-743 nm 전송 밴드 쿼드-밴드 대역 통과 필터를 사용 하 여 관찰. (B) 2 개의 256 × 256 하위 스택 원래 512 × 512 스택에서 잘립니다 했다. (C) 해당 스택에 61 순차적 프레임을 사용 하 여 인수 하는 이미지. (왼쪽) SYTOX 오렌지 스테인드 DNA, (중간) Qdot705-오크, (오른쪽) 병합 된 이미지; 표시 3 Qdot705-λ-ARS317 DNA 기판에 ARS317 사이트에서 레이블이 오크 바인딩 검은 화살표를 사용 하 여 표시 했다. (D) 그림 바인딩 DNA에 위치 하는 오크의 계산. LDNA DNA 길이, L오크 거리에서에서 의미 오크 DNA의 속박 되 끝에 DNA에 사이트를 바인딩. (E) λ-ARS317 DNA에 바인딩 분포를 히스토그램의 오크. 데이터에 맞게 가우시안 빨간색 실선을 사용 하 여 표시 했다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간 1000 부트스트랩 샘플에 따라 나타냅니다. N 오크 분자의 수를 의미합니다. 삽입 하는 ARS317 사이트는 검은색 화살표를 사용 하 여 표시 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 오크 Qdot 표시 바인딩 (3:1 어 금 니 비율) λ-ARS317에. 오크 및 λ-ARS317 DNA 그림 3A에서와 같은 방법에서 관찰 되었다. (왼쪽) SYTOX 오렌지 스테인드 DNA 532 nm 레이저를 사용 하 여 흥분 했다. (중간) Qdot 표시 된 오크 405 nm 레이저를 사용 하 여 흥분 했다. (오른쪽) 병합 된 이미지입니다. Λ-ARS317 DNA 기판에 ARS317 사이트에 두 오크 Qdot 표시 바인딩 검은 화살표를 사용 하 여 표를 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 선물이 Qdot 표시 된 단백질 및 흐름 셀에서 TIRFM는을 사용 하 여 site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 관찰 하는 프로토콜. 필요한 단계는 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름-세포 준비, 및 단일 분자 이미징 사이트 수정 포함 됩니다. 주목 해야 한다 두 가지 요점을 확인 하 고 있습니다. 첫째, λ DNA와 관련 된 단계, 예를 들어, 어떤 가능한 손상 감소를 부드럽게 조작 해야 모든 반복적으로 아래로 pipetting으로 혼합을 피하. 둘째,는 coverslip 충분히 깨끗 하 고는 배경 잡음을 최소화 되도록 매우 중요 하다. Coverslip 청소 및 기능화 과정 물, 초순 수준에 도달 해야 하며 공기 먼지 무료. Coverslip 기능화 및 흐름 셀 조립 깨끗 한 벤치에서 실시 하는 것이 낫다.
단백질 DNA 상호 작용을 공부에 대 한 단일 분자 분석 실험, λ DNA에서는 여러 장점을20적절 한 기판입니다. Λ DNA 충분히 쉽게 관찰 될 단일 분자 실험에서 그것에 단백질 운동 기록 허용 하는. 또한, ssDNA 돌출부 유리 coverslip에 λ DNA tethering 많은 디자인을 허용 한다. 이 연구에서 우리는 λ DNA의 특정 사이트에서 외 인 DNA 조각을 삽입 하는 방법을 제시. 따라서, 다양 한 사용자 정의 가능한 DNA 파편 λ DNA에 통합 될 수 있습니다. 수정된 λ DNA 단일 분자 연구에 대 한 대량 액체 lysates에서 편리 하 게 정화 될 수 있다.
Streptavidin 입히는 Qdot Qdot nanocrystal 당 약 5-10 streptavidins 있기 때문에 분석 결과 라벨에 정확 하 게 라벨 효율성을 평가 하는 것이 어렵습니다. 따라서, streptavidin 입히는 Qdots 및 biotinylated 단백질의 적절 한 어 금 니 비율 실험에 최적화 되어야 합니다. 1:1 어 금 니 비율 참조일 수 있습니다.
그것은 그것의 높은 사진 안정성 사진 표백 분석 결과에 적합 하지 않습니다 이후 Qdot 정확한 정량 분석에 사용할 수 없습니다 유의 하십시오. Qdots의 높은 안정성 정량 분석에의 응용을 제한, 하지만 그것은 쉽게 관찰과 장기간 추적5수 있습니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜 응용 생물학, 단일 분자 형광 현미경 검사 법의 증가 함께 DNA 대사의 미래에 메커니즘을 탈피에 크게 기여할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 닥터 하 산 Yardimci 감사 하 고 종류의 프랜시스 크릭 연구소의 Dr.Sevim Yardimci 도움이 단일 분자 실험에의 컬럼비아 대학, 박사 에릭 C. 그린의 연구소에서 박사 다니엘 Duzdevich 박사 유지 북경 대학교의 태양과의 Chunlai 첸 박사 칭화 대학 유용한 토론에 대 한입니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 31371264, 31401059, CAS 혁신 팀과 뉴턴 고급 친교 (NA140085)에서 왕 사회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
