효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사
Summary
이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.
Abstract
싹 트는 효 모 단백질 인간의 질병와 관련 된 공부에 모델로 널리 사용 되었습니다. 게놈 전체 유전자 검사는 일반적으로 효 모 연구에 사용 되는 강력한 도구입니다. 다양 한 효 모에 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 식이 세포 독성 및 집계 형성, 업과 연구 결과 이러한 장애를 가진 환자에서 발생 합니다. 여기, 그 독성의 한정자 루 경화 증 관련 단백질 FUS의 효 모 모델을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 변환을 사용 하 여, 대신이 새로운 심사 플랫폼 효 모 모델에 플라스 미드의 기준점과 라이브러리를 소개 하는 효의 짝짓기에 의존 합니다. 짝짓기 방법에는 두 명확한 이점이 있다: 첫째로, 그것은 매우 효율적인; 둘째, 플라스 미드의 사전 변환 된 기준점과 라이브러리 저장할 수 있습니다 글리세롤 주식으로 장기적이 고 신속 하 게 효 모 모델에 변환의 노동 집약 단계 없이 다른 스크린에 적용에 대 한 각 시간. 어떻게이 방법은 성공적으로 사용할 수 있습니다 설명 수정 FUS의 독성 유전자에 대 한 화면으로.
Introduction
싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae 널리 사용 되었습니다 기본 과학 연구1 에 직접 인간의 질병에 관련 된 세포 프로세스를 이해 하. 또한, 그것은 사용 되는 모델 생물으로 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병, 그리고 루를 포함 하 여에 연결 등 인간의 질병 관련 단백질, 공부에 대 한 옆 경화 증 (ALS)2. 효 모 모델의 장점은는 게놈 넓은 스크린 따라서 그들의 독성의 메커니즘에 대 한 통찰력을 주는 질병 관련 단백질의 독성에 관련 된 세포 경로 식별 하기 위해 수행할 수 있는 용이성입니다. 이러한 한 화면은 기준점과 라이브러리에 5500 효 모 유전자 각각의 어떤 유전자 독성 overexpressed 때 수정할 수 있습니다 식별 하는 효 모 모델로 변환 됩니다 overexpression 라이브러리 화면을 이라고 합니다. 이 검사 방법은 여러 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 Huntington의 질병3, 파 킨 슨 병4,5 α-synuclein huntingtin 포함 효 모 모델에 성공적으로 적용 된 , 알 츠 하이 머 병6, FUS 및 TDP-43 ALS7,,89Aβ. 일반적으로는 높은 처리량 방법10에서 이루어집니다, 하는 동안 화면의 가장 노동 집약적인 단계는 개별적으로 기준점과 라이브러리에서 5500 효 모 유전자 변형 시키는. 심사, 반복 때마다가이 단계를 수행 해야 합니다 그리고 때마다 새로 설립된 된 효 모 모델 공부 될 필요가 있다. 그것은이 작업을 수행 하는 더 효율적인 방법을 찾을 수 해야 합니다.
효 모 세포는 단일과 2 중 형태로 안정적으로 존재할 수 있습니다. 두 유형의 단일 셀, 짝짓기 형식 짝짓기 반대는 각 짝짓기의 α. 단일 셀 생산을 입력 하 고 짝짓기 형식 셀 반대만 응답 하는 그들의 자신의 특정 짝짓기 페로몬을 분 비 하는 고. 이로써 간의 짝짓기는 생산 안정 된 2 중 세포, / α α 세포. 이 과정은 자발적이 고 매우 효율적인11. 우리 플라스 미드 도서관 소개 S. cerevisiae 의이 독특한 라이프 사이클의 활용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, 기준점과 플라스 미드 도서관에서 각 유전자 한 짝짓기 종류, 즉, α 셀의 단일 세포로 변형 됩니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 이러한 셀 다음 글리세롤 주식 기준점과 96 잘 형식에서에 저장 됩니다. 상영 하는 각 효 모 모델, 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에서 재개 수 있습니다 되 고 반대 짝짓기 종류, 즉, 짝짓기 종류의 효 모 모델 짝짓기를 통해 심사를 할 수 있는 한. 효 모에 두 개의 유전자를 함께가지고 짝짓기를 사용의이 아이디어를 새로운 되지 않습니다. 2 하이브리드 심사, 있는 미끼 생성 한 짝짓기 형식에 (즉, Gal4 DNA 바인딩 도메인 융해) 소집 짝짓기 기준점과 라이브러리에서 먹이 구조를 통해 높은 처리량 효 모에 성공적으로 적용 된 그러나 12.,이 전략 적 overexpression 라이브러리 검 진, 항상 전통적인 변환 방법 사용에 적용 되었습니다.
우리의 실험실 이전 ALS 관련 단백질 FUS7의 효 모 모델을 설립. 변환 메서드를 사용 하 여 overexpression 라이브러리 심사를 통해 우리 FUS overexpressed 때의 독성을 구출 하는 5 개의 효 모 유전자를 (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, 및 VHR1)을 발견 했다. 이들이 발견 했다 독립적으로 확인 하지 비슷한 연구와 다른 그룹8. hUPF1, ECM32의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포13 와 ALS14 도의 동물 모델에서 독성을 억제 하기 위해 표시 했다. 이 5 개의 유전자를 사용 하 여 원리의 증거로, 그들은 짝짓기에 의해 FUS 효 모 모델에 소개 될 때 모든 5 개의 유전자 마찬가지로 FUS 독성을 구조 설명 합니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에 영구적으로 저장 하 고 필요할 때마다 부활 수 있습니다, 이후이 짝짓기 기반 메서드 변환 라이브러리에 대 한 검사를 해야 할 때마다 시간이 많이 걸리는 단계를 제거 합니다. 짝짓기 하는 것이 없는 플라스 변환 관련 고효율 이후이 전략 또한 크게 정화 및 큰 플라스 미드 도서관의 변화와 관련 된 비용을 줄입니다. 우리 도서관 FUS의 효 모 모델에 대 한 심사를 성공적으로이 메서드를 적용 됩니다.
짝짓기 기반 검사 절차 그림 1에 간략하게 설명 되어 있습니다. 처음, 기준점과 플라스 미드 도서관 종류 α 96 잘 접시의 각 잘 포함 효 모 특정 라이브러리 플라스 미드로 변형 되어 있는 높은 처리량 효 모 전이 프로토콜을 사용 하 여 짝짓기의 단일 효 모 긴장으로 변화 됩니다. 이 컬렉션 변환 효 해 동 하 고 나중에 사용 하기 위해 부활 수 있는 글리세롤 주식으로 저장 됩니다. 이 경우 FUS 독성에 관심사의 효 모 모델 반대 짝짓기 형식과 단일 효 모 스트레인에 생성 해야 합니다 (유형 짝짓기는). 살 균 96 핀 복제기를 사용 하 여 높은 처리량으로, FUS 긴장과 플라스 미드 도서관을 포함 하는 효 모 종자는 96 잘 접시 포함 된 리치 미디어를 전송 하며 수 친구. 짝짓기, 각 작은 볼륨 다음 짝짓기 문화의 잘 96 잘 접시 합성 강하 미디어 모두 FUS를 포함 하는 2 중 효 모에 포함 된 전송 및 라이브러리 유전자 성장할 수 있다. 로봇 탐지 기계는 FUS 및 라이브러리 유전자의 표정을 유도 된 한 천 배지 위에 각 우물에서 효 모 문화를 전송에 사용 됩니다. 또한, 효 모 문화는 어디 FUS 및 라이브러리 유전자 표현 되지 않는다 하는 한 천 배지를 제어 하 발견 됩니다. 한 천 배지에서 성장, 다음 구조 또는 악화 FUS 독성 유전자 식별 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 짝짓기 사용 하 여 효 모 모델에 플라스 미드 도서관을 소개 하는 효 모에 플라스 미드 overexpression 화면 수행 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 신경 퇴행 성 질병 단백질 독성의 여러 효 모 모델 수 상영 플라스 미드 도서관으로 변형 하는 효 모의 동일한 컬렉션을 사용 하 여. 변화의 힘 드는 과정만는 고효율 효 모 후 쿼리 스트레인에 플라스 미드 도서관을 소개 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 주 실험실 및 종 실험실, 라이트 주립 대학에서 재정 지원의 구성원과 사려깊은 토론에 대 한 감사.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
Riferimenti
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