Summary
تقدم هذه المقالة طريقة التزاوج القائم لتسهيل فحص أوفيريكسبريشن في مهدها الخميرة استخدام مكتبة صفت بلازميد.
Abstract
الخميرة مهدها قد استخدمت على نطاق واسع كنموذج لدراسة البروتينات المرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان. الفحص الوراثي على نطاق الجينوم أداة قوية التي يشيع استخدامها في الدراسات الخميرة. التعبير عن عدد من البروتينات المرتبطة بأمراض الأعصاب في الخميرة الأسباب سيتوتوكسيسيتي وتشكيل التجميعية، ولخص النتائج في المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات. هنا، يمكننا وصف طريقة لفحص نموذج خميرة من البروتين المرتبط بالتصلب العضلي الجانبي فوس لمعدلات سميته. بدلاً من استخدام التحويل، هذا البرنامج فحص جديدة تعتمد على التزاوج من الخميرة لإدخال لمكتبة أراييد من البلازميدات في نموذج الخميرة. يحتوي الأسلوب على التزاوج اثنين من مزايا واضحة: أولاً، أنها ذات كفاءة عالية؛ ثانيا، يمكن تخزين مكتبة والبلازميدات arrayed قبل تحويلها للطويلة الأجل أسهم والغليسيرول وتطبيقها بسرعة على شاشات أخرى دون أن الخطوة كثيفة العمالة للتحول إلى نموذج الخميرة في كل مرة. ونحن تثبت كيف يمكن أن تستخدم هذا الأسلوب بنجاح على الشاشة للجينات التي تعديل سمية فوس.
Introduction
مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae كانت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الأساسية1 فهم العمليات الخلوية التي تتصل مباشرة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وعلاوة على ذلك، قد استخدمت ككائن نموذج لدراسة البروتينات البشرية المرتبطة بالمرض، مثل تلك المرتبطة بأمراض الأعصاب الأكثر شيوعاً، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون والجانبي الضموري 2من التصلب الجانبي (المرض). ميزة نموذج الخميرة هو السهولة التي يمكن أن يؤديها شاشة على نطاق الجينوم لتحديد المسارات الخلوية المتصلة بسمية البروتينات ذات الصلة بالمرض، مما يعطي نظرة ثاقبة إليه سميتها. شاشة واحدة من هذا القبيل يطلق على شاشة مكتبة overexpression، فيه كل من جينات الخميرة 5,500 في مكتبة أراييد تتحول إلى نموذج خميرة على تحديد الجينات التي يمكن تعديل السمية عند أوفيريكسبريسيد. هذا أسلوب الفرز قد طبقت بنجاح في نماذج الخميرة متعددة الأعصاب المرتبطة بالمرض البروتينات، بما في ذلك هونتينجتين لمرض هنتنغتون3، α-سينوكلين لمرض باركنسون4،5 ، Aβ6من مرض الزهايمر، وفوس، ماساتشوستس-43 للمرض7،،من89. الخطوة كثيفة العمالة أكثر من الشاشة على حدة في حين أنه يتم عادة في طريقة الفائق10، هو تحويل جينات الخميرة 5,500 من مكتبة أراييد. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في كل مرة يتم تكرار الفحص، وكلما نموذجا خميرة المنشأة حديثا تحتاج إلى دراسة. من المهم إيجاد وسيلة أكثر كفاءة لإنجاز هذه المهمة.
[ستبلى] يمكن أن توجد خلايا الخميرة في أشكال فرداني والنباتات على حد سواء. هناك نوعان من المقابلة للتزاوج أنواع الخلايا فرداني، يزاوج نوع والخلايا α. فرداني للتزاوج كل نوع تنتج وتفرز فرمون التزاوج المحددة الخاصة بهم، التي تستجيب فقط الخلايا نوع التزاوج المعاكس. وهذا يسمح للتزاوج بين والخلايا α لإنتاج الخلايا ضعفاني مستقرة،/α. هذه العملية هي عفوية وذات كفاءة عالية11. يمكن لنا أن نستفيد من هذه دورة حياة فريدة من نوعها S. cerevisiae لإدخال بلازميد المكتبة. وبشكل أكثر تحديداً، ستحول كل الجينات في مكتبة صفت بلازميد إلى الخلايا فرداني من نوع التزاوج واحد، أي، خلية α. سيتم تخزين هذه الخلايا التي تحتوي على جينات مكتبة ثم والغليسيرول الأسهم في شكل 96-جيدا أراييد. لكل طراز الخميرة التي تحتاج إلى فحص، يمكن إذابة خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة من المخزون والغليسيرول، ويمكن أن يتم الفحص عن طريق التزاوج مع نموذج الخميرة من اهتمام بالمقابل التزاوج نوع، أينوع التزاوج. هذه الفكرة من استخدام التزاوج للجمع بين اثنين من الجينات في الخميرة ليست جديدة. قد طبقت بنجاح في الخميرة الفائق الفرز الهجين اثنين، فيه بناء طعم (أي، Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الأنشطار) في نوع التزاوج واحد جمعت عن طريق التزاوج مع بنية بري من مكتبة أراييد 12-غير أن هذه الاستراتيجية لم تطبق ابدأ في عروض مكتبة أوفيريكسبريشن، التي استخدمت دائماً طرق التحويل التقليدية.
قبل إنشاء مختبرنا نموذج خميرة فوس البروتين المرتبط بالمرض7. من خلال الفحص مكتبة أوفيريكسبريشن باستخدام أسلوب التحويل اكتشفنا خمس جينات الخميرة (ECM32، NAM8، SBP1، SKO1، و VHR1) أن إنقاذ سمية فوس عند أوفيريكسبريسيد. وتأكدت هذه النتائج بشكل مستقل مع دراسة مماثلة بآخر مجموعة8. وأبدى hUPF1، homolog الإنسان من ECM32، لاحقاً لقمع السمية في الخلايا العصبية الأولية13 وفي نموذج حيوان من المرض14 كذلك. باستخدام هذه الجينات الخمسة كدليل على المبدأ، علينا أن نبرهن أن الجينات خمس جميع المثل إنقاذ فوس السمية عند إدخالها في نموذج الخميرة فوس بالتزاوج. حيث يمكن تخزينها بشكل دائم في الأسهم والغليسيرول خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة وإحياء كلما دعت الحاجة، سيتم إزالة هذا الأسلوب القائم على التزاوج خطوة وقتاً طويلاً لتحويل كل مرة المكتبة بحاجة إلى فحص ضد. منذ التزاوج ذات كفاءة عالية بأي تحويل بلازميد المعنية، هذه الاستراتيجية أيضا إلى حد كبير يقلل التكلفة المرتبطة بتنقية وتحويل مكتبة بلازميد كبيرة. سوف نطبق هذا الأسلوب بنجاح إلى مكتبة الفرز ضد الخميرة نموذج فوس.
إجراء الفرز على أساس التزاوج يرد بإيجاز في الشكل 1. في البداية، تتحول إلى سلالة خميرة فرداني من التزاوج α نوع استخدام بروتوكول تحول الفائق خميرة التي يحتوي على كل من لوحة 96-جيدا جيدا الخميرة تحول مع بلازميد مكتبة محددة المكتبة بلازميد صفت. يتم حفظ هذه المجموعة من الخميرة المحولة كمخزون والغليسيرول يمكن إذابة وإحياؤها لاستخدامها في وقت لاحق. نموذج الخميرة من الاهتمام، في هذه الحالة سمية فوس، يجب أن يتم إنشاؤها في سلالة خميرة فرداني مع نوع التزاوج المعاكس (التزاوج نوع). في طريقة الفائق باستخدام معقم 96-دبوس مثاليان، سلالة فوس وسلالات الخميرة التي تحتوي على مكتبة بلازميد يتم تحويلها إلى لوحات 96-البئر الذي يحتوي على الوسائط الغنية، ويسمح لرفيقه. بعد التزاوج، كمية صغيرة من كل بئر الثقافة التزاوج يتم نقلها إلى 96-جيدا لوحات تحتوي على وسائط الإعلام التسرب الاصطناعية في الخميرة مثنوية فقط التي تحتوي على كلا فوس ومكتبة الجينات يمكن أن تنمو. ثم يتم استخدام جهاز اكتشاف روبوتية لنقل الثقافة الخميرة من كل بئر على لوحات أجار فيها فعل التعبير عن فوس والجينات المكتبة. بالإضافة إلى ذلك، رصدت الثقافة الخميرة للتحكم في لوحات أجار حيث فوس والجينات مكتبة لا يعبر عن. في أعقاب النمو على ألواح أجار، سيتم تحديد الجينات التي إنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا صمم لفحص والبلازميدات مكتبة الواردة في عشر لوحات 96-جيدا لكن يمكن تحجيمها صعودا أو هبوطاً تبعاً لذلك. البروتوكول يحتاج إلى تكرار لإكمال فحص مكتبة كاملة. عادة، يمكن أن تعالج بشكل مريح الفحص ضد 10 لوحات من الجينات مكتبة في كل مرة بشخص واحد.
1-الإعداد للتحول الخميرة 96-جيدا
ملاحظة: هذه الخطوة ويتم ذلك كما سبق وصف7،10.
- الكوة 5 ميليلتر (حوالي 50 – 100 نانوغرام) من بلازميد الحمض النووي من مكتبة بلازميد المنتشرة في كل من لوحة 96-بئر مستديرة القاع جيدا.
ملاحظة: سيكون مثالاً لتلك المكتبة خميرة جينات overexpression مكتبة10. - تلقيح 150 مل من الخميرة ببتون سكر العنب (YPD) وسائط الإعلام في قارورة 500 مل مع مستعمرة (2-3 مم) من سلالة الخميرة فرداني W303α. تبني عليها بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة).
- في صباح اليوم التالي، قياس OD600 الثقافة بين عشية وضحاها، وتمييع ثقافة الخميرة OD600 = 0.1 في (تصل إلى) 2 لتر YPD. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة) ح ~ 5 حتى يصل إلى الثقافة OD600 = 0.4 – 0.6.
2-الخميرة التحول
- حصاد الثقافة الخميرة بملء 8 زجاجات الطرد المركزي العقيمة 250 مل وسينتريفوجينج لهم في درجة حرارة الغرفة في س 3,000 ز للحد الأدنى 10 من أجل إيقاف المادة طافية دون تعطيل بيليه.
ملاحظة: القيام بجميع الخطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. - أغسل الخميرة مع العقيمة المقطر H2o. لهذا، إضافة 100 مل من العقيم ح2س لكل زجاجة للطرد المركزي ودوامه أن ريسوسبيند بيليه الخلية. دمج الخلايا غسلها 2 زجاجات والطرد المركزي لهم في س 3,000 ز 5 كحد أدنى من أجل إيقاف المادة طافية.
- تغسل الخلايا في كل زجاجة في 100 مل من 0.1 م ليواك/1XTE (100 مم ليواك؛ 10 ملم تريس، pH 8.0; 1 مم يدتا) والطرد المركزي لهم في 3,000 س ز 5 كحد أدنى من أجل إيقاف المادة طافية.
- بينما سينتريفوجينج، يغلي 5 مل من سمك السلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي (10 مغ/مل) عند 100 درجة مئوية باستخدام سخان كتلة لمدة 3 دقائق وثم تبرد على الجليد.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 25 مل من 0.1 م ليواك/1XTE في كل زجاجة، والجمع بين الخلايا ريسوسبينديد ونقلها إلى قارورة 150 مل. إضافة 5 مل من الحيوانات المنوية السلمون يبرد قبل الحمض النووي واحتضان أنه عند 30 درجة مئوية مع الهز (225 لفة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.
- صب الخليط خلية في خزان كاشف المتاح عقيمة، واستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 35 ميليلتر من الخليط خلية لكل بئر من الجولة-أسفل لوحة 96-البئر الذي يحتوي على مكتبة بلازميد الحمض النووي. لوحات دوامة 96-البئر باستخدام فورتيكسير طبق لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة. احتضان لوحات لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية دون المصافحة.
ملاحظة: لا المكدس اللوحات، وحتى يمكن نقل الحرارة أكثر كفاءة. وقد وجدنا أن فورتيكسينج لوحات 96-بئر 1,000 لفة في الدقيقة لا يسبب السائل إلى تسرب من الآبار، ولكن ينبغي اختبار سرعة دوامة آمنة قبل القيام بالخطوة. - وفي قارورة، تعد 200 مل من تحويل المخزن المؤقت الذي يحتوي على تركيز نهائي من 40% PEG3350 و [دمس] 10% 0.1 م ليواك. إعداد المخزن المؤقت التحول فورا قبل الاستخدام ومزجها جيدا بالهز.
- لوحات إزالة 96-جيدا من الحاضنة 30 درجة مئوية ومزجها لمدة 30 ثانية 1,000 لفة في الدقيقة باستخدام فورتيكسير لوحة. إضافة 125 ميليلتر من المخزن المؤقت التحول لكل بئر ومن ثم دوامة لوحات لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة.
- احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وثم الحرارة صدمة الخميرة بوضع اللوحات في حاضنة 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: لا المكدس اللوحات. - الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز. إزالة المخزن المؤقت التحول من الآبار بعكس اللوحات على حاوية نفايات وبقوة إلقاء المخزن المؤقت من اللوحات. لطخة لوحات مقلوبة على منشفة ورقية نظيفة لإزالة أي سائل على رأس اللوحات بسرعة.
- شطف الخلايا عن طريق إضافة إلى ميليلتر 200 لوحات من التسرب الحد الأدنى المتوسط المقابلة لعلامة اختيار على بلازميد المكتبة.
ملاحظة: قمنا باستخدام وسيلة اتفاق جولة أوروغواي اصطناعية. - الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز وإزالة المادة طافية على حاوية نفايات كما في الخطوة 2، 10.
- إضافة 160 ميليلتر أورا-المتوسطة تحتوي على حد أدنى 2% الجلوكوز. دوامة لوحات لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة واحتضانها لهم عند 30 درجة مئوية عن 48 ساعة دون المصافحة. بعد 48 ساعة، ملاحظة أن بيليه خميرة المحولة مرئياً في الجزء السفلي من كل بئر.
- استخدام موزع سائلة، إضافة 100 ميليلتر من اتفاق جولة أوروغواي، وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز في كل من مجموعة جديدة من لوحات 96-جيدا جيدا.
- دوامة لوحات تحتوي على الخميرة المحولة (من الخطوة 2، 13) 1,000 لفة في الدقيقة لمدة 30 س. باستخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس بلاستيك عقيمة ووضع الدبابيس في الآبار التي تحتوي على الخميرة المحولة وتطعيم لهم ثم إلى الآبار المقابلة للوحات الجديدة مليئة بوسائل الإعلام. احتضان لوحات جديدة عند 30 درجة مئوية ح 24.
ملاحظة: إذا كان يعمل مع 10 لوحات، المتوسط يمكن أيضا يمكن الاستغناء عن يدوياً باستخدام الماصات متعدد القنوات. - بعد 24 ساعة، ينبغي أن يكون بيليه خميرة مرئية في الجزء السفلي من كل بئر يحتوي على الخميرة المحولة بنجاح. لحفظ هذه سلالات الخميرة كمخزون والغليسيرول، إضافة 50 ميليلتر من الجلسرين 50% لكل بئر، دوامة لوحات لمدة 30 ثانية 1,000 لفة في الدقيقة، ختم اللوحات مع ختم الشريط وتجميدها في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: الخطوات المذكورة أعلاه تحتاج إلى تتم مرة واحدة فقط. البدء من مخزونات والغليسيرول العروض المستقبلية لنماذج مختلفة من الخميرة ضد نفس مكتبة كاشف المتاح الخزان والشروع فورا من الخطوات المذكورة أدناه.
3-التزاوج بين الخلايا التي تحتوي على جينات مكتبة والخميرة الاستعلام
- لإنعاش سلالات مكتبة من المخزون والغليسيرول، تأخذ لوحات 96-جيدا للخروج من الثلاجة-80 درجة مئوية، إزالة الشريط الختم، وترك الخميرة ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة حوالي 30 دقيقة.
- بمجرد قد إذابة الخميرة، استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس بلاستيك عقيمة لتطعيم الأرصدة والغليسيرول إلى 160 ميليلتر الطازجة التي تحتوي على اتفاق جولة أوروغواي-وسائط 2% الجلوكوز في لوحات 96-جيدا واحتضانها لهم عند 30 درجة مئوية ل 24 h. فورا بعد أن يتم استخدام سلالات المكتبة ، ختم اللوحات مع ختم الشريط، وإعادتها إلى الثلاجة-80 درجة مئوية.
- في نفس اليوم هي إذابة سلالات مكتبة (W303α)، تطعيم سلالة الخميرة الاستعلام (هنا، فوس في W303a) إلى 50 مل YPD، وأنها تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
- في صباح اليوم التالي، صب سلالة الخميرة الاستعلام إلى خزان كاشف المتاح عقيمة، والكوة ميليلتر 160 من سلالة الاستعلام لكل بئر من صفيحة 96-جيدا ماصة متعددة باستخدام.
- استخدام موزع السائلة، الاستغناء عن 160 ميليلتر من YPD وسائل الإعلام في كل من عشر لوحات 96-جيدا جيدا. استخدام هذه اللوحات في وقت لاحق للتزاوج سلالة الخميرة الاستعلام مع الخميرة المكتبة.
- باختصار دوامة سلالة لوحة 96-كذلك يتضمن سلالة الاستعلام ومن ثم استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس معقم لنقل الاستعلام إلى لوحات YPD.
- باختصار دوامة المكتبة سلالة لوحات، وكل لوحة مكتبة السلالة، استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس معقم جديدة لنقل سلالات مكتبة إلى لوحات YPD التي قد تم تلقيح مع سلالة الاستعلام.
ملاحظة: الخلايا في والغليسيرول تفقد صلاحيتها بعد عدة دورات تجميد ذوبان الجليد. العودة سلالات مكتبة للتخزين طويل الأجل (الثلاجة-80 درجة مئوية) أقرب الاحتفاظ المكتبة في ذات نوعية جيدة، وجاهزة للاستخدام في المستقبل. حفظت بشكل صحيح، يمكن تجميد الأسهم والغليسيرول وإذابة 10 مرات على الأقل. نوصي بشدة أيضا حفظ نسخة عمل ونسخ احتياطية من الأسهم والغليسيرول. عندما لا يعمل العامل المخزون، فورا جعل جديدة تعمل نسخة من نسخة احتياطية. - احتضان لوحات YPD عند 30 درجة مئوية ل h. 24 علما أن بيليه خميرة سيكون مرئياً في الجزء السفلي من كل بئر بعد 24 ساعة.
- لوحات ملء 96-جيدا مع متوسط تسرب الحد أدنى الذي يحتوي على 2% رافينوسي، المقابلة لعلامات التحديد على بلازميد في سلالة الاستعلام وكذلك على بلازميد المكتبة (مثلاً، هنا أورا-له-).
- استخدام النسخ متماثل 96-دبوس عقيمة لنقل الخميرة من YPD التزاوج الثقافات لوسائط الإعلام الانتقائي. احتضان لوحات 96-جيدا عند 30 درجة مئوية عن 48 ساعة؛ الخميرة فقط الخلايا التي قد تزاوج وشكلت مثنوية الخلايا لذلك، تحتوي على كلا بلازميد الاستعلام وبلازميد المكتبة سوف تكون قادرة على النمو في هذه الوسائط. بعد يومين، نلاحظ أن بيليه مرئياً في الجزء السفلي من الآبار.
4-اكتشاف الإنزيم
-
بعد 48 ساعة نمو في وسائل الإعلام الانتقائي التي تحتوي على رافينوسي، على الفور الخميرة لوحات أجار.
- إعداد مجموعات من لوحات أورا-صاحب التسرب تتضمن أجار 2% باستخدام ألواح البوليسترين واضحة وواحدة تحتوي على اللبن 2% والجلوكوز 2% أخرى تحتوي على 2.
- لوحات دوامة 96-جيدا لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة، ثم بقعة الخميرة لوحات أورا-صاحب الانقطاع عن الدراسة التي تحتوي على اللبن 2% واجار 2% (هي التي يسببها الجينات فوس ومكتبة) ولوحات أورا-صاحب التسرب الذي يحتوي على الجلوكوز 2% و 2% أجار (الجينات فوس ومكتبة القمع) باستخدام جهاز اكتشاف روبوتية، التي رصدت الثقافة في كل جيدا على لوحات أجار في البيلوروسية (أيالثقافة في 1 كذلك رصدت للبقع 4 على لوحة أجار).
- بعد أن شاهد، اسمحوا لوحات أجار الجاف، وثم وضعها في حاضنة 30 درجة مئوية رأسا على عقب. تصوير لوحات أجار كل 24 ساعة لتسجيل نمو أسرع/أكثر خميرة التي أنقذت السمية على سلالة الاستعلام أو تسجل نمواً أبطأ/أقل من الذي يتفاقم السمية على سلالة الاستعلام. احتضان اللوحات لمدة 4 أيام.
ملاحظة: الثقافة في كل جيدا يمكن رصدها على ألواح أجار 1 إلى 1, كما هو موضح في أسلوب المستندة إلى التحول سابق10. ومع ذلك، 1-إلى-4 شاهد هنا (والتي يمكن وضع مريح حتى باستخدام آلة اكتشاف الروبوتية) يزيد بشكل كبير مدى متانة المقايسة بالحد من العدد إيجابيات كاذبة. وتعتبر الزيارات إيجابية فقط عندما تظهر جميع المستعمرات 4 من نفس جيدا النمط الظاهري مماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتين المرتبط بالمرض فوس، الحمض النووي الريبي/DNA بروتين، درست سابقا في الخميرة فرداني7،8. الوراثية الفحص باستخدام الأسلوب القائم على التحول اكتشفت عدة جينات الخميرة التي تقمع سمية فوس. Homolog الإنسان واحدة من جينات الخميرة اتضح فيما بعد أن تكون فعالة في قمع السمية في الخلايا العصبية الأولية ونموذج الفئران من ALS13. هنا، نقوم باستخدام نفس نموذج الخميرة لإظهار أن overexpression مكتبة الفرز يمكن أن يؤديها التزاوج بشكل فعال بالتحول.
فوس سامة لخلايا الخميرة فرداني والنباتات على حد سواء
وأجرى طراز الخميرة السابقة فوس وفرز مكتبة overexpression اللاحقة في الخلفية الخلية فرداني. للأسلوب القائم على التزاوج للعمل، بحاجة إلى إثبات في الخميرة مثنوية سمية فوس. للقيام بهذا، نحن تزاوج نموذج الخميرة فوس في w303a (التزاوج نوع) مع w303α تحول مع موجه فارغ (التزاوج نوع α). وكما هو مبين في الشكل 2، على الرغم من أن سمية فوس لا كقوى كما هو الحال في الخميرة فرداني، يتجلى في الخميرة مثنوية.
التعرف على الجينات قمع سابقا عمل في الخميرة مثنوية
كدليل على مبدأ للأسلوب القائم على التزاوج، قمنا باختبار الجينات الخمسة المحددة سابقا من الأسلوب القائم على التحول. التزاوج كان يستخدم لإدخال كل من الجينات الخمسة في نموذج الخميرة فرداني فوس (في W303a)، وقد تم اختبار قدرتها على إنقاذ سمية فوس في الخميرة مثنوية اللاحقة (W303a/α). كما هو موضح في الشكل 3، إنقاذ جميع الجينات خمسة سمية فوس في الخميرة مثنوية، مما يشير إلى أن الأسلوب التزاوج الفعال.
لفحص تجريبي من الجينات 940 (صفت على عشر لوحات 96-جيدا)
عقب البروتوكولات المذكورة أعلاه، يمكننا تطبيق الأسلوب القائم على التزاوج فحص مكتبة overexpression من الجينات 940. 4 الشكل يعرض صورة للوحة ممثل واحد. وكما هو مبين في الجانب الأيمن من الشكل (الجينات فوس ومكتبة وأعرب)، كان فوس السامة للخميرة مثنوية. الجين مكتبة أشار إلى جانب الساحة الخضراء إنقاذ سمية فوس في حين أشارت بالساحة الحمراء إلى تعزيز سمية.
الشكل 1 : الرسم التخطيطي لفحص نماذج الخميرة سمية البروتين باستخدام التزاوج. مكتبة بلازميد (تحت سيطرة المروج GAL1 الذي هو الغاية التي يسببها حضور اللبن) تتحول إلى سلالة خميرة فرداني (MATα) باستخدام بروتوكول تحول الفائق. هذه المجموعة من الخميرة، تحولت مع والبلازميدات المكتبة، يتم تخزينها كمخزون والغليسيرول في-80 درجة مئوية، ويتم أحياء عند الحاجة إلى رفيقه مع نموذج الخميرة فرداني سمية البروتين (في حالتنا، نسخة واحدة من فوس المتكاملة في محور HIS3، GAL1 المروج ، ماتا). مثنوية الخميرة تحتوي على مكتبة بلازميد والبروتينات السامة (فوس) هي المحدد ورصدت للسكر (الجين فوس ومكتبة 'إيقاف') ولوحات أجار اللبن (الجين فوس ومكتبة 'على'). وتلت نمو الخميرة إلى تحديد الجينات التي إنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس. الساحة الخضراء تشير إلى مثال الجينات القامع أن تنقذ سمية فوس، والساحة الحمراء تشير إلى مثال للجينات محسن الذي يزيد من حدة سمية فوس عند أوفيريكسبريسيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : فوس سامة لخلايا الخميرة فرداني والنباتات على حد سواء. الخميرة فرداني (w303 ماتا) تحول مع pRS303Gal1-فوس تحول مع بلازميد فارغة أو تزاوج مع الخميرة نوع التزاوج المعاكس (w303 MATα) تحول مع بلازميد فارغة ذاته لتوليد سلالة خميرة مثنوية. وكانت هذه سلالات الخميرة جنبا إلى جنب مع سلالة تحكم ثم 5 × متسلسل المخفف (من اليسار إلى اليمين) ورصدت لاتفاق جولة أوروغواي-صاحب الجلوكوز المتوسطة (اليسار، فوس التعبير مكبوتة) واتفاق جولة أوروغواي-صاحب اللبن المتوسطة (يمين، الناجم عن التعبير فوس). التقطت الصورة بعد يومين نمو في 30 درجة مئوية. قد لوحظ النمو متطابقة تقريبا من سلالة تحكم فرداني والنباتات، فقط كان سيظهر سلالة تحكم فرداني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : خمس جينات الخميرة (ECM32، NAM8، SBP1، SKO1، و VHR1) إنقاذ سمية فوس من خلال الأسلوب القائم على التزاوج. البلازميدات المحتوية على الجينات التي سبق تحديدها الخميرة التي تقمع سمية فوس تحولت إلى سلالة خميرة فرداني (w303 MATα). ثم تم تزاوج هذه الخميرة مع الخميرة فرداني من نوع التزاوج المعاكس (w303 ماتا) تحول مع بلازميد تعبير فوس. وكان الخميرة مثنوية تتضمن فوس وأما موجه فارغ أو واحد من الجينات قمع خمسة replicates المحددة ورصدت في لوحات أجار المحتوية على الجلوكوز (الجينات 'إيقاف') واللبن (الجينات 'على'). (1) يظهر تحولت سلالة خميرة عنصر تحكم مع اثنين من ناقلات فارغة. (2) يبين سلالة الخميرة فوس مثنوية مع موجه فارغ حيث يتم التعبير عن فوس سامة جداً. (3-7) إظهار الخميرة مثنوية معربا عن فوس، فضلا عن قمع جينات التي يمكن إنقاذ سمية فوس. كل رقم (1-7) يظهر صفين من اثني عشر مطابقة يتطابق. تم التقاط الصورة، تمثل ثلاث تجارب مستقلة، بعد 3 أيام نمو في 30 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : مكتبة فحص للجينات أن الإنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس. وكان تزاوج فرداني الخميرة التي تحتوي على فوس مع الخميرة فرداني المحتوية على الجينات مكتبة. بعد التزاوج، تحديد مثنوية الخلايا التي تحتوي على فوس وجين مكتبة ورصدت للسكر (الجينات فوس ومكتبة 'إيقاف') واللبن ثم لوحات أجار (الجينات فوس ومكتبة 'على') في البيلوروسية. على لوحة اللبن، التي أبديت فوس والجينات مكتبة، كانت معظم الخميرة غير قادر على النمو أيضا. وهذا يشير إلى أن فوس السامة وكانت معظم مكتبة جينات غير قادر على إنقاذ سمية. الساحة الخضراء يوضح مثال على مكتبة الجين يقمع سمية فوس ويسمح الخميرة على شكل مستعمرات. الساحة الحمراء تشير إلى مثال على مكتبة الجين الذي يزيد من حدة سمية فوس. اللوحات المعروضة هنا هي ممثل 10 لوحات من مكتبة الجينات التي تم فحص ضد. التقطت الصورة بعد 3 أيام نمو في 30 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يمكننا وصف بروتوكولا لأداء شاشة overexpression بلازميد في استخدام التزاوج لإدخال بلازميد المكتبة في نموذج الخميرة الخميرة. باستخدام هذا النهج، يمكن فحص نماذج متعددة من الخميرة سمية البروتين أمراض الأعصاب باستخدام نفس المجموعة من الخميرة تحول مع مكتبة بلازميد. عملية شاقة للتحول يحتاج فقط إلى إجراء مرة واحدة، وبعد فيه الخميرة ذات كفاءة عالية التزاوج يستخدم لإدخال بلازميد المكتبة في سلالة الاستعلام. يعتمد هذا البروتوكول على استخدام المعدات الآلية الاستغناء عن وسائل الإعلام والثقافات الخميرة بقعة على لوحات أجار. في حين يمكن أن يؤديها البروتوكول دون استخدام المعدات الآلية، ستكون أكثر استهلاكاً للوقت. وكان هذا الأسلوب بنجاح المستخدمة على الشاشة للجينات التي يمكن تعديل سمية فوس.
ولاحظنا أن فوس أقل قليلاً في الخلفية الخميرة النباتات السامة. هذا الأكثر احتمالاً بسبب عدد نسخ الجينات والفروق في معدل نمو الخميرة مثنوية. إلا النمط الظاهري الذي قيد الدراسة التزاوج نوع أو تعتمد على بلويدي، والنمط الظاهري النمو عن السمية يتسق في الخميرة فرداني والنباتات. وبسبب هذا، يتوقع الأسلوب القائم على التزاوج للعمل على نطاق واسع في العديد من نماذج مختلفة النمو تعمل الخميرة. ومع ذلك، ينبغي التحقق من النمط الظاهري طراز الخميرة للتأكد من أنها لا تزال موجودة في الخلفية ضعفاني قبل أن يتم تنفيذ هذا الأسلوب الفرز. هذا الأسلوب يمكن استخدامها لدراسة تعمل مختلفة كثيرة في الخميرة ولا يقتصر على دراسة سمية البروتين الأعصاب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أي بلازميد المكتبة التي تحتوي على الخميرة التعبير المتجهات.
بعد أداء الشاشة، وهناك عدد من فحوصات التحقق التي سوف تساعد على ضمان أن يضرب المحددة محددة إلى نموذج الخميرة يجري فرزهم. ينبغي اختبار القدرة على سميتها في الخميرة دون المشاركة الإعراب عن البروتين المرض للفائدة. ينبغي إلغاء معززات يسبب سمية مستقلة من البروتين المرض للفائدة من إجراء المزيد من الدراسة. من المهم أن تنظر سواء المكثفات سمية تؤثر على التعبير عن البروتين الأمراض التي تؤثر على مروج Gal1. ينبغي إزالة أي المكثفات التي تؤثر على التعبير من المروج Gal1 من إجراء المزيد من الدراسة.
سلالات الخميرة التي تحتوي على بلازميد المكتبة مخزنة بشكل دائم في الأسهم والغليسيرول ويمكن إحياؤها بسرعة عند الحاجة إليها حيث أن الأسلوب القائم على التزاوج يمكن تطبيقها بسهولة على نماذج الخميرة الأخرى التي تحتاج إلى فحص ضد الجينات المكتبة نفسها. كفاءة الأسلوب القائم على التزاوج يصبح واضحا عندما يتم استخدام نفس النوع من الفحص لإزالة المغلوطة أو عند نماذج مختلفة من الخميرة متعددة تحتاج إلى دراسة. لقد استخدمت بنجاح هذا الأسلوب للشاشة طراز خميرة من ماساتشوستس-43، البروتين أخرى مرتبطة بالمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لمناقشات عميقة مع الأعضاء في جو المختبر ومختبر تشونغ، والدعم المالي من جامعة ولاية رأيت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
